脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠脊髓背角淺層組織NR-1表達及意義

王建設，叢靜，謝永剛

(1威海市文登中心醫院，山東威海264200；2煙臺毓璜頂醫院)

?

脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠脊髓背角淺層組織NR-1表達及意義

王建設1，叢靜1，謝永剛2

(1威海市文登中心醫院，山東威海264200；2煙臺毓璜頂醫院)

目的觀察脊髓損傷(SCI)后慢性中樞性疼痛(CCP)大鼠脊髓背角淺層組織中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR-1的表達變化，并分析其意義。方法32只大鼠中隨機取16只采用改良重物墜擊脊髓法建立SCI模型，造模6 d時出現CCP 8 只(CCP組)、未出現CCP 8只(SCI組)；另取8只僅暴露脊髓不行打擊(假手術組)，8只不做任何處理者為對照組。造模14 d采用免疫組化法檢測各組大鼠脊髓背角淺層組織NR-1蛋白。結果CCP組、SCI組、假手術組、對照組脊髓背角淺層NR-1蛋白相對表達量分別為0.13±0.01、0.08±0.01、0.07±0.01、0.07±0.02，CCP組NR-1相對表達量明顯高于其余各組(P均<0.05)，SCI組、假手術組、對照組間差異無統計學意義。結論SCI后CCP大鼠脊髓背角淺層存在NR-1高表達，NR-1可能參與了SCI后CCP的發生、發展。

脊髓損傷；慢性中樞性疼痛；N-甲基-D-天冬氨酸；受體亞單位

脊髓損傷(SCI)是脊柱損傷最嚴重的并發癥，可引起脊柱功能性或器質性損害，導致患者出現運動及感覺功能障礙。SCI后運動功能的恢復是臨床治療的重點，但其伴發的慢性中樞性疼痛(CCP)常被忽略，臨床缺少有效治療方法[1]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR-1是傳導疼痛信號的主要受體，其在SCI后CCP發生發展中作用的相關報道較少。 2014年4月～2015年10月，我們觀察了SCI后CCP大鼠脊髓背角淺層組織NR-1蛋白的表達，并分析其意義，旨在為SCI后CCP的診治提供依據?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性2～4周齡SD大鼠32只，由煙臺毓璜頂醫院動物中心提供，體質量220～250 g，室溫20～24 ℃、12 h明暗循環下飼養1周。NR-1一抗稀釋度1∶400，Zymed公司，美國)及生物素標記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶200，Santa Cruz公司，美國)，7371型機械測痛儀購自美國IITC公司，37400型熱測痛儀購自香港萬浩科技有限公司。

1.2動物分組及干預32只大鼠中隨機取16只采用改良重物墜擊脊髓法[2]建立SCI模型：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，切開背部皮膚分離肌肉，咬骨鉗咬除脊椎L1節段椎板，分離3～4 mm切口充分暴露脊髓。400 g/cm(下落高度20 cm、打擊重量20 g)打擊力度打擊脊髓1次，打擊完后縫合切口，注射青霉素(8萬單位/次，1次/d，連續3 d)預防切口感染。術后行手法排尿持續到大鼠能自主排尿,防止出現SCI術后尿潴留。大鼠脊髓受到打擊時出現肢體抽動即視為造模成功，16只大鼠均造模成功。造模6 d時根據文獻[2]判定出現CCP 8只(CCP組)、未出現CCP 8只(SCI組)，另取8只大鼠僅暴露脊髓不行打擊(假手術組)，8只不做任何處理者為對照組。

1.3脊髓背角淺層組織NR-1蛋白檢測采用免疫組化法。分別于造模14 d取各組大鼠，腹腔注射麻醉后處死。以L1棘突為中心分離暴露脊髓，并取L1節段鄰近脊髓組織各1 cm。將所取組織常規固定、脫水、石蠟包埋，組織切片后進行抗原修復。滴加1∶400 NR-1一抗室溫孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次；生物素標記的1∶200稀釋的兔抗小鼠二抗，室溫下孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，封片。NR-1陽性表達為脊髓背角淺層呈淡黃色加深。采用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統測出切片底色灰度值，然后自動進行免疫反應區域的彩色分割，測定光密度。所有切片均在同一光度下測定，測定3次，取平均值，以光密度作為NR-1蛋白相對表達量。

2　結果

CCP組、SCI組、假手術組、對照組脊髓背角淺層組織NR-1蛋白相對表達量分別為0.13±0.01、0.08±0.01、0.07±0.01、0.07±0.02，CCP組NR-1相對表達量明顯高于其余各組(P均<0.05)，SCI組、假手術組、對照組間差異無統計學意義。

3　討論

CCP是SCI后發生的一種頑固性疼痛，表現為損傷平面以下持續的自發痛和誘發痛。既往研究發現，中樞痛覺敏化是導致CCP的最初原因。多數學者認為，其發生發展與SCI后所引起的感覺通路失平衡及遞質或受體失衡有關，然而其具體作用機制目前尚不明確。目前，臨床常使用外周電刺激及傳統的藥物止痛療法治療SCI后CCP，但效果較差。

脊髓背角淺層是整個脊髓背角中神經活性受體含量豐富且種類繁多的部位，以往研究認為其為傳導痛覺的第一站[3]。脊髓背角神經元可接受外周感覺神經的傳入，將神經信號換元處理后傳遞至海馬，最終將神經沖動傳遞到大腦皮層感覺區。NMDA受體是一種典型的興奮性氨基酸受體，可調控神經元樹突、軸突結構的發育，參與突觸可塑性的形成，是學習和記憶過程中的重要受體。其包含很多受體亞單位，其中NR-1是傳導疼痛信號的主要受體亞單位[3,4]。NR-1含有一個結合甘氨酸的位點，是構成離子通道的基本亞單位。以往研究發現，NMDA受體的激活能夠激活一系列與痛覺信號傳遞密切相關的信號通路，該受體功能被激活是引起神經病理性疼痛中樞敏化的關鍵機制之一，NR-1是其重要組成部分[5～8]。脊髓背角淺層受損后，由NR-1亞單位激活所誘發的突觸長時程增強，導致異常痛覺過敏的發生[9,10]。脊髓損傷后，由炎癥反應所介導的過氧化反應可以導致痛覺過敏的發生。該過程主要是通過誘導脊髓背角淺層NMDA受體亞單位NR-1的磷酸化而產生,而NR-1受體的激活與其磷酸化密切相關[11,12]。研究發現，大鼠脊髓內注射NMDA受體激動劑可升高大鼠興奮性氨基酸的分泌、上調NMDA受體NR-1的表達水平，導致大鼠出現理毛、自噬等過度修飾行為及機械痛和熱痛覺過敏現象[13～15]。本研究發現，CCP組NR-1相對表達量明顯高于其余各組，SCI組、假手術組、對照組間差異無統計學意義。說明SCI后CCP的發生與脊髓背角淺層NR-1蛋白的激活密切相關，推測其可能作用機制為：①SCI可導致脊髓背角淺層受體失平衡，導致興奮性受體NR-1大量產生；②SCI后的炎性反應導致過氧化物大量產生并進一步使受體磷酸化,NR-1被大量激活。

綜上所述，SCI后CCP大鼠脊髓背角淺層組織存在NR-1表達升高，NR-1可能參與了SCI后CCP的發生、發展。

[1] 呂國蔚.痛覺過敏的中樞敏感化機制及其分子基礎[J].中國疼痛醫學雜志,1996,2(2):114-117.

[2] 戴紅，肖忠新，胥小汀，等. 一種新的實驗性脊髓損傷中樞性疼痛動物模型的建立[J].中國康復醫學雜志，2002，17(1)：18-22.

[3] Hawwa N, Baliki M,Atweh SF, et al. Attenuation of neuropathic pain by segmental and suppaspinalactivationof the dorsal column system in awake rats[J]. Neuro Sci, 2002,18(3):541-553.

[4] 吳江，黃德櫻，程潔，等. 電刺激坐骨神經對新生期大鼠脊髓背角淺層及海馬CA1區突觸可塑性及c-fos蛋白表達的影響[J]. 中華醫學雜志，2012，92(41)：2938-2942.

[5] Wu J, Hu Q, Huang D, et al. Effect of electrical stimulation of sciatic nerve on synaptic plasticity of spinal dorsal horn and spinal c-fos expression in neonatal juvenile and adult rats[J]. Brain Res, 2012,1448(45):11-19.

[6] Xie YG, Mu HJ, Li Z,et al. Supression of chronic central pain by superoxide dismutase in rats with spinal cord injury:inhibition of the NMDA receptor implicated[J]. Exp Ther Med，2014,8(4):1137-1141.

[7] Kwak KH, Han CG, Lee SH, et al. Reactive oxygen species in rats with chronic postischemia pain[J]. Acta Anaest Scand,2009, 53(6):648-656.

[8] Cavanaugh DJ, Lee H, Lo L, et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009,106(22):9075-9080.

[9] Bennett AD, Everahart AW, Hulsebosch CE. Intrathecal NMDA and non NMDA receptor antagonists reduce mechanical but not thermal allodynia in a rodent model of chronic central pain after spinal cord injury[J]. Brain Res, 2009,859(21):72-78.

[10] Biber K, Laurie DJ, Berthele A,et al.Expression and signaling of group I metabotropic glutamate receptors in astrocytes and microglia[J]. Neuro,2003,72(12): 1671-1680.

[11] Muscoli C, Mollace V, Wheatley J, et al. Superoxide-mediated nitration of spinal manganese superoxide dismutase: a novel pathway in N-methyl-D-aspartate-mediated hyperalgesia[J]. Pain, 2010,111(21):96-103.

[12] Gao X, Kim HK, Chung JM. Reactive oxygen species (ROS) are involved in enhancement of NMDA receptor phosphorylation in animal models of pain[J]. Pain, 2007,131(26):262-271.

[13] Kim K, Ha M, Jung K, et al. Reactive oxygen species and NMDA receptor mediated central sensitization in hindlimb ischemia reperfusion injury-induced neuropathic pain rats [J]. Korean J Anest, 2009,56(12):186-194.

[14] Hulsebosch CE, Hains BC, Crown ED, et al. Mechanisms of chronic central neuropathic pain after spinal cord injury[J]. Brain Res Rev,2009,60(15):2002-2013.

[15] 劉舒佳，李建軍，高峰.脊髓損傷后中樞性疼痛的研究[J]. 中國康復理論與實踐，2009,15(2):114-116.

謝永剛(E-mail: xyglzxrx@sina.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.013

R651.2

A

1002-266X(2016)18-0040-02

2015-12-15)