尿液長鏈非編碼RNA H19對乳腺癌的診斷價值

張開炯，張毅，羅政蓮，吳立春,張莉，劉靳波

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2四川省腫瘤醫院)

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·臨床研究·

尿液長鏈非編碼RNA H19對乳腺癌的診斷價值

張開炯1，張毅1，羅政蓮1，吳立春2,張莉2，劉靳波1

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2四川省腫瘤醫院)

目的觀察尿液長鏈非編碼RNA(lncRNA)H19對乳腺癌的診斷價值。方法采用RT-PCR法檢測30例乳腺癌患者(觀察組)、42例健康體檢者(對照組)尿液H19 mRNA水平，并分析H19與臨床病理資料的關系，繪制ROC曲線分析尿液H19對乳腺癌的診斷價值。結果觀察組尿液H19 mRNA相對表達量明顯高于對照組，P<0.05；尿液H19 mRNA水平與c-erbB-2癌基因有關(P=0.002)，而與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、雌激素受體、孕激素受體及血管內皮生長因子受體無關(P均>0.05)。ROC曲線顯示,H19曲線下面積為0.72，其診斷乳腺癌的敏感性為72.4%、特異性為67.8%。結論乳腺癌患者尿中H19水平升高，尿液H19可作為乳腺癌篩查的一個潛在的無創性生物標志物。

乳腺癌；長鏈非編碼RNA；尿液；癌基因；生物標志物

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，目前發病率居于我國女性腫瘤發病率首位，病死率居于女性腫瘤第4位[1]。由于乳腺癌起病隱匿，臨床確診時多數已為晚期，治療效果較差。目前乳腺癌的早期篩查和預后監控的血液學指標主要為糖類抗原(CA)153、27、29和癌胚抗原(CEA)等，但敏感性和特異性均較差，且對患者有一定創傷性。因此，尋找一類靈敏度高、特異性強且無創的乳腺癌新型診斷標志物成為研究熱點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本>200個核苷酸，缺少特異完整的開放閱讀框，無蛋白質編碼功能的RNA分子[2]，其可通過表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平調控腫瘤的發生、發展及轉移。H19是一個具有父系印記特性的lncRNA分子，其能否作為一個無創性早期診斷靶標存在于乳腺癌患者尿液標本中目前尚無相關報道。2015年1～9月，我們檢測了30例乳腺癌患尿者液中的H19 mRNA，并分析其與臨床資料的關系，旨在為乳腺癌的診斷和預后判斷提供臨床依據。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇我院同期收治的乳腺癌初診女性患者30例(觀察組)，年齡(50.30±2.45)歲，患者均術前診斷乳腺癌且術后病理確診；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅱ～Ⅳ期9例；伴淋巴結轉移12例，未出現淋巴結轉移18例；雌激素受體(ER)陽性20例，ER陰性10例；孕激素受體(PR)陽性19例，PR陰性11例；c-erbB-2癌基因陰性21例，c-erbB-2陽性9例；血管內皮生長因子受體(Ki67)≤10%者8例，Ki67>10%者22例。同時采集42例同期健康女性體檢者作為對照組，年齡(48.83±1.98)歲，兩組年齡差異無統計學意義。本研究經本院倫理委員會同意，兩組均簽署知情同意書。

1.2尿液H19 mRNA檢測采用RT-PCR法。分別留存兩組晨尿400～500 mL，1 500 r/min離心30 min，吸取250 μL尿沉渣置于RNA保存液中,-80 ℃保存備用。按照試劑說明書要求，提取尿標本中的總RNA，逆轉錄生成cDNA。以β-actin作為內參，采用相對定量2-ΔΔCt法計算兩組尿液H19 mRNA水平。H19及β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：β-actin上游5′-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3′，下游5′-GCACGAA-GGCTCATCATTCA-3′；H19上游5′-GGTAGAAAAAG-CAACCACGAAGC-3′，下游：5′-ACATAAACCTCTG TCTGTGAGTGCC-3′。采用SYBRy Premix Ex TaqⅡ試劑盒(大連寶生物)檢測每個擴增循環后SYBRy Green熒光信號水平，總反應體系20 μL，反應條件：95 ℃、30 s預變性；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環。實驗重復3次。

2　結果

2.1兩組尿液H19 mRNA水平比較觀察組和對照組尿液H19 mRNA分別為5.23±2.27和1.97±2.79，P<0.05。

2.2乳腺癌患者尿液H19 mRNA水平與臨床病理特征的關系見表1。

2.3尿液H19 mRNA水平對乳腺癌的診斷價值繪制ROC曲線后發現AUC為0.72，敏感性和特異性分別為72.4%(95%CI：0.528～0.873，P<0.05)和67.8%(95%CI：0.513～0.812，P<0.05)。

3　討論

近年研究發現，循環核酸如循環DNA、信使RNA以及微小RNA可穩定存在于人體血液、尿液、腦脊液等標本中，與腫瘤的發生發展密切相關[3]。尿液標本由于具有留取方便且無創的特點，從而成為疾病臨床診斷、預后及大規模人群篩查的理想媒介。

近年來，H19被廣泛地報道參與了腫瘤的發生、發展，而H19在腫瘤中的作用存在爭議。研究發現，在Wilm腫瘤、胚胎橫紋肌肉瘤及貝克威斯綜合征中，H19被認為是腫瘤抑制基因[4]，而在其他大部分腫瘤中H19發揮著癌基因的作用，如膀胱癌、子宮頸癌、食管癌及胃癌等[5～8]。在乳腺癌中，H19表達增高，其可通過生長因子、轉錄因子及ER調控乳腺癌細胞增殖、分化和侵襲進程[9～11]。Shore等[12]研究發現，H19在乳腺癌組織中的表達水平與ER及PR相關；其可與缺氧誘導因子、轉錄因子、p53等相互作用，調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲等過程。Matouk等[13]對乳腺癌原發灶和轉移灶中的H19進行檢測發現，無論在原發灶還是轉移灶中H19均表達增高，且H19能夠通過miR-675上調Slug表達，下調E-cadherin表達，從而調控乳腺癌上皮間質轉化，并促進乳腺癌細胞的侵襲轉移。最近，Vennin等[14]研究發現，H19作為miR-675的前體可在體外增強乳腺癌細胞的增殖和遷移，在體內增強腫瘤的生長和轉移。此外，H19/miR-675能夠下調泛素連接酶E3家族(c-Cbl、Cbl-b)，促進腫瘤細胞的增殖和轉移。

最近研究發現，H19能夠穩定存在于胃癌患者血漿中，且血漿中H19水平能夠作為胃癌早期診斷及預后監測的有效分子標記[15]。本研究發現，觀察組尿液H19 mRNA水平明顯高于對照組，且其水平與c-erbB-2有關。通過對尿中高表達的H19繪制ROC曲線，發現AUC為0.72，敏感度和特異性分別為72.4%和67.8%，表明乳腺癌患者尿液中的H19有望成為乳腺癌早期診斷和預后監控的新型生物標志物。然而，我們未能發現尿液H19水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、ER、PR及Ki67的有關。這可能與本研究納入標本量少有關，后續我們將擴大樣本進一步分析。

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Diagnostic value of urinary lncRNA H19 for breast cancer

ZHANGKaijiong1,ZHANGYi,LUOZhenglian,WULichun,ZHANGLi,LIUJinbo

(1AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo investigate the diagnostic value of urinary long non-coding RNA (lncRNA) H19 for breast cancer. MethodsThe urinary H19 levels were detected in 30 patients with breast cancer (observation group) and 42 healthy controls (control group) by using quantitative RT-PCR, and the correlations between urinary H19 levels and clinical characteristics were further analyzed in breast cancer patients. Receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluate the diagnostic value of urinary H19 for breast cancer. ResultsCompared with the control group, the expression level of urinary H19 in the observation group was significantly increased (P<0.05), and the expression level of urinary H19 was significantly related with c-erbB-2 (P=0.002), but was not related with TNM stages, lymph node metastasis, estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and Ki67 expression (allP>0.05). The area under the ROC curve (AUC) was 0.72, and the sensitivity and specificity were 72.4% and 67.8%, respectively. ConclusionThe expression level of urinary H19 increases in patients with breast cancer, and urinary H19 may serve as a noninvasive biomarker for the diagnosis of breast cancer.

breast carcinoma; long non-coding RNA; urine; oncogene; biomarker

四川省科學技術廳專項資金(14JC0801)。

劉靳波(E-mail： liujb7203@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.014

R737.14

B

1002-266X(2016)18-0042-03

2015-12-12)