肺炎雙球菌轉化實驗難點剖析

甘肅 張仲林

肺炎雙球菌轉化實驗難點剖析

甘肅 張仲林

肺炎雙球菌轉化實驗是現行人教版高中生物必修2教材中證明DNA是遺傳物質的證據的經典實驗，也是高考命題的熱點之一。教材中簡練的文字、圖解及深奧的轉化理論，給學生留下了一些難點。為了幫助學生更好地理解這個實驗，現對這些難點作一些探討。

一、莢膜的成分及作用

莢膜是某些細菌細胞壁外的一層較松厚而且較固定的黏液性物質，主要由水、多糖或多肽組成。莢膜的作用有：

（1）防止細菌變干。這是由于莢膜中含有水分。

（2）吸附陽離子。有些莢膜含有羧基基團，能吸附陽離子。

（3）防止噬菌體的侵襲。

（4）防止被吞噬細胞吞噬和消化。

（5）許多細菌通過莢膜相互連接，形成體積較大的菌膠團，這在防止被吞噬細胞吞噬中起著重要作用。

S型細菌的菌體有莢膜，R型細菌的菌體無莢膜。S型細菌能侵染和寄生在人體內，引起肺炎，也能侵染其他哺乳類動物如兔、馬，還能侵染家鼠，引起敗血癥。

S型細菌的菌體有莢膜，進入機體后，受莢膜的保護，能抵抗吞噬細胞的吞噬和消化作用，從而迅速繁殖、擴散，能引起機體發生疾病，嚴重時引起死亡。這就是肺炎雙球菌轉化實驗中將有毒性的S型活細菌注射到小鼠體內，小鼠患敗血癥死亡的原因。

R型細菌無莢膜，能被吞噬細胞吞噬、消化，所以不能使機體患病。這也就是肺炎雙球菌轉化實驗中將無毒性的R型活細菌注射到小鼠體內，小鼠不死亡的原因。

致病與否，關鍵是看細菌有無莢膜。

二、轉化的概念及條件

轉化是受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得供體菌部分遺傳性狀的現象。

S型肺炎球菌和小鼠不是同種。自然條件下肺炎球菌和小鼠的細胞間遺傳物質是不會轉移的。這就是肺炎雙球菌轉化實驗中將加熱殺死后的S型細菌注射到小鼠體內，小鼠不死亡的原因。

并非任意兩株R型菌和S型菌之間的接觸都能發生轉化。研究發現，凡能發生轉化的R型菌必須處于感受態。感受態是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現轉化的生理狀態。它雖受遺傳控制，但表現卻差別很大。外界環境因子如環腺苷酸（cAMP）和Ca2＋對感受態有重要影響。如cAMP可使嗜血桿菌屬的細菌感受態水平提高1萬倍。

處于感受態的R型細菌分泌感受態因子，其中有細胞壁自溶素，使R型細菌的局部細胞壁溶解掉，從而使其細胞膜表面的膜連DNA結合蛋白和核酸酶暴露出來。

轉化因子是離體的DNA片段。一般原核生物的擬核是由一個大型的環狀DNA分子反復折疊盤繞而成的。但不管在自然條件或人為條件下，都極易斷裂成碎片。由于每個細胞表面能與轉化因子相結合的位點有限，所以轉化的頻率極低，通常為0.1%～1%。

三、加熱殺死的S型細菌中的DNA是否具有遺傳效應？

S型細菌加熱到一定程度（60～100℃），其蛋白質的分子結構受到破壞而喪失生物活性，加熱引起的蛋白質變性是導致S型細菌死亡的原因。被加熱殺死的S型細菌通過自溶過程，釋放出部分DNA片段。有些DNA片段中含有控制莢膜合成的基因。但60～100℃的溫度只能使DNA的氫鍵斷開、雙螺旋解體，而不會引起DNA分子的降解和一級結構的破壞。由于堿基互補配對作用，當溫度逐漸降低后，分離的DNA單鏈會重新聚合、雙螺旋結構重新恢復。因此，在一定溫度范圍內，加熱殺死的S型細菌中的DNA是具有遺傳效應的。

基因工程中采用PCR技術擴增目的基因時，模板DNA經加熱至90～95℃一定時間后，使模板雙鏈DNA解離，成為單鏈；模板DNA與引物退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至37～60℃，引物與模板DNA單鏈的互補序列結合也利用了加熱這一原理。

四、加熱殺死后的S型細菌中的DNA是否進入了R型活細菌的細胞中？

1928年，英國科學家格里菲思將加熱殺死后的S型細菌和R型活細菌混合后注射到小鼠體內，結果不僅有許多小鼠死于敗血癥，而且從死鼠血液中還發現了活的S型細菌。

1944年，美國科學家艾弗里發現，只有S型細菌的DNA組分能夠把R型細菌轉化成S型細菌，而且DNA的純度越高轉化的效率也越高。這說明，一種基因型細胞的DNA進入了另一種基因型的細胞后，可引起穩定的遺傳變異，DNA賦有特定的遺傳特性。

加熱殺死的S型菌的含有控制莢膜形成基因的DNA片段，與感受態受體菌R型細菌表面的膜連DNA結合蛋白相結合，其中一條DNA單鏈被核酸酶水解掉，另一條DNA單鏈進入R型細菌細胞中，與R型細菌核區環狀DNA的同源區段配對重組，形成一小段雜合的DNA片段。

隨著雜合R型細菌的分裂增殖，后代會出現S型細菌和R型細菌兩種細菌。這些轉化成的S型細菌的后代也是有毒性的S型細菌，可見這種性狀的轉化是可以遺傳的。實質上，R型細菌轉化成S型細菌屬于基因的重組。

通過轉化最初形成的S型細菌數量極少，但S型細菌在小鼠細胞中大量繁殖、擴散，使小鼠患敗血癥死亡。

五、肺炎雙球菌轉化實驗證明了什么？

肺炎雙球菌轉化實驗是一個直接證據，證明性狀本身是不遺傳的。在肺炎雙球菌轉化實驗中，多糖類是不遺傳的，而遺傳物質才是遺傳的。在當時的實驗室技術條件下，做了肺炎雙球菌轉化實驗的格里菲思無法知道“轉化因子”是什么。后來才有了艾弗里的分離實驗，證實“轉化因子”就是DNA。

六、細菌的遺傳轉化只見于肺炎雙球菌嗎？

遺傳轉化是指同源或異源的游離DNA分子（質粒和染色體DNA）被自然或人工感受態細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉移過程。

自然轉化現象首先是在肺炎雙球菌中發現的，70多年來已經發現許多細菌屬中的某些種或某些株有自然轉化的能力。近十多年來的研究已表明，通過自然轉化進行的基因轉移過程已不只是一種“實驗室現象”，而是廣泛存在于自然界，可能是自然界進行基因交換的重要途徑。環境中（土壤、水體、沙粒等）是否發生自然轉化，主要取決于環境中是否存在具有轉化活性的DNA分子及可吸收DNA的感受態細胞。

研究表明，幾乎所有的生活細菌都可向環境中主動分泌或因細胞死亡裂解而釋放DNA，這些DNA分子可與固型物（土粒、沙粒子）結合而得到保護，免受降解，從而能長時間存留于環境中并具有轉化活性，另一方面，自然感受態作為許多細菌應付不利生活條件的一種調節機制，在自然環境中的存在具有普遍性。

目前發現的具有轉化現象的細菌除肺炎雙球菌外，還有枯草桿菌、葡萄球菌、根瘤菌、奈瑟氏菌、嗜血桿菌等細菌以及少數真菌。

轉化與兩種細菌的親緣關系有關，轉化一般只發生在同一物種或近緣物種之間。

在人工條件下的遺傳轉化，為許多不具有自然轉化能力的細菌（如大腸桿菌）提供了一條獲取外源DNA的途徑，也是基因工程的基礎技術之一。

【例1】肺炎雙球菌中的S型具有多糖類莢膜，R型則不具有。下列敘述錯誤的是 （ ）

A.培養R型活細菌時加S型細菌的多糖類物質，能產生一些具莢膜的細菌

B.培養R型活細菌時加S型細菌DNA的完全水解產物，不能產生具莢膜的細菌

C.培養R型活細菌時加S型細菌的DNA，能產生具莢膜的細菌

D.培養R型活細菌時加S型細菌的蛋白質，不能產生具莢膜的細菌

【解析】莢膜的形成是受基因控制的。培養R型活細菌時加S型細菌的多糖類物質，沒有控制莢膜形成的基因，所以不能產生一些具莢膜的細菌，故A錯。S型細菌DNA的完全水解產物中也無控制莢膜形成的基因，不能產生具莢膜的細菌，故B對。培養R型活細菌時加S型細菌的蛋白質，因蛋白質不是遺傳物質，不能控制莢膜的形成，故D對。

【答案】A

【例2】肺炎雙球菌轉化實驗中，能夠證明DNA是遺傳物質的實驗設計是 （ ）

A.將無毒R型活細菌與有毒S型活細菌混合后培養，發現R型細菌轉化成S型細菌

B.將無毒R型活細菌與加熱殺死的S型細菌混合后培養，發現R型細菌轉化成S型細菌

C.從加熱殺死的S型細菌中提取DNA、蛋白質、多糖，分別加入培養R型細菌的培養基中，發現R型細菌轉化成S型細菌

D.從S型活細菌中提取DNA、蛋白質、多糖，分別加入培養R型細菌的培養基中，發現只有加入DNA，R型細菌才轉化成S型細菌

【解析】在當時的實驗室技術條件下，做了肺炎雙球菌轉化實驗的格里菲思無法知道“轉化因子”是什么。后來才有了艾弗里的探究實驗，艾弗里從加熱殺死的S型細菌中提取DNA、蛋白質、多糖，分別加入培養R型細菌的培養基中，發現R型細菌轉化成S型細菌的分離實驗，證實“轉化因子”就是DNA。

【答案】D

【例3】1944年美國科學家艾弗里（Avery）和他的同事從S型活細菌中提取出了DNA、蛋白質和多糖等物質，然后將它們分別加入已培養了R型細菌的培養基中，結果發現：只有加入了DNA，R型細菌才能轉化為S型細菌，而加入蛋白質和多糖的培養基中，R型細菌不能發生這種變化。這一現象說明了：①S型細菌的性狀是由DNA決定的；②在轉化過程中，S型細菌的DNA進入到了R型活細菌細胞中；③S型細菌的DNA是遺傳物質；④R型細菌的DNA不是遺傳物質；⑤蛋白質和多糖不是遺傳物質；⑥蛋白質和多糖在該實驗中起對照作用 （ ）

A.①②④⑥ B.①②③④

C.①②③⑤⑥ D.①②③④⑤⑥

【解析】艾弗里（Avery）和他的同事從S型活細菌中提取出了DNA、蛋白質和多糖等物質，然后將它們分別加入已培養了R型細菌的培養基中，觀察R型細菌的變化。并沒有提取出R型細菌DNA，所以不能得出R型細菌的DNA不是遺傳物質的結論。

【答案】C

（作者單位：甘肅省渭源縣第三高級中學）