酶標儀與血小板聚集儀測定血小板抗低滲休克反應的比較分析

甘新宇,楊　洋,趙景嵐,于麗君

(成都軍區總醫院輸血科,四川成都 610083)

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·臨床研究·

酶標儀與血小板聚集儀測定血小板抗低滲休克反應的比較分析

甘新宇,楊洋,趙景嵐,于麗君

(成都軍區總醫院輸血科,四川成都 610083)

摘要:目的通過與血小板聚集儀法進行比較，建立用酶標儀測定血小板低滲休克反應(HSR)的方法。方法分別用酶標儀和血小板聚集儀對含不同比例新鮮血小板的富血小板血漿進行HSR檢測，并對這兩種方法的靈敏度、準確度和重復性進行比較分析。結果酶標儀法和血小板聚集儀法測得HSR分別為(65±24)%和(69±20)%，靈敏度均為20%；采用酶標儀法和血小板聚集儀法對分別含75%、50%、25%球形血小板樣品重復測定10次，變異系數(CV)分別為10.3%、5.2%、3.5%和11.0%、6.2%、4.1%；HSR測定值準確度與球形血小板百分比相關,其相關系數r分別為0.959 8和0.968 4。結論酶標儀法與血小板聚集儀法對HSR的測定無明顯差異，酶標儀可用于HSR的標準化檢測。

關鍵詞:血小板低滲休克反應；酶標儀；血小板聚集儀

血小板低滲休克反應(HSR)是指血小板(PLT)在滲透壓低的環境中會發生腫脹變形，一定時間后又可恢復其原有形狀，這種變形后又恢復的能力是反映PLT功能的一項重要指標，它與PLT的回收率和存活時間呈正相關[1-2]。目前，國內HSR檢測方法尚未標準化，常用方法包括分光光度計檢測法和血小板聚集儀檢測法[2-3]。本研究利用酶標儀對HSR進行檢測，并與血小板聚集儀檢測法進行靈敏度、準確度和重復性等方面的對比研究，分析酶標儀法檢測HSR的效能?，F報道如下。

1材料與方法

1.1樣品制備[4]采用血小板單采儀采集1個治療量的PLT，取10 mL乏血小板血漿(PPP)，加入單采PLT調節PLT濃度至(250～300)×109/L，即富血小板血漿(PRP),將其分為兩份：(1)1份PLT懸液放入專用PLT保存箱中靜置25 h，再振蕩1 h，即為100%的正常PLT；(2)另1份加入2 g/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)后，放入2～4 ℃冰箱儲存24 h，取出放入PLT專用保存箱靜置1 h，再振蕩1 h，即為100%的球形PLT。兩份均用羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液調節pH值至7.0后待用。

1.2主要儀器Thermo MK3型酶標儀(天津開元醫療有限公司)，500CA型血小板聚集分析儀(美國Chrono-log公司)，ABX60型血細胞計數儀(日本Sysmex公司)。

1.3方法

1.3.1血小板聚集儀法測定HSR[4]將血小板聚集儀攪拌速度旋鈕調至刻度10并開機預熱30 min，然后將PPP、PRP、磷酸鹽緩沖液(PBS)和蒸餾水4種液體放入預熱槽中預熱10 min。吸取500 μL PRP和PPP至兩個測試杯中，攪拌加有PPP的測試杯后放置到測試位,調節基線至0%～100%，待基線穩定后吸取250 μL PBS加入到PPP中，立即運行30 s，記錄PBS的吸光度(A)值(以X表示)；吸取250 μL蒸餾水加入PRP中行相同測試，記錄A值，待A值達到平衡后終止測定，記錄樣品最大A值(以Y表示)和最小A值(以Z表示)。計算HSR=[(Y-Z)/(Y-X)]×100%。

1.3.2酶標儀測定HSR[5]分別取樣品3份，同時測定HSR并取測定結果的平均值。(1)測定最小吸光度(A0)和恢復15 min后吸光度(A15)：在96孔酶標板微孔中加入200 μL蒸餾水，再加入樣品100 μL，蒸餾水調零，以630 nm波長作為主波長，450 nm波長為第2波長，用MK3型酶標儀測定樣品的A0，并于15 min后振蕩15 s再次測定該樣品的A15。(2)測定最大吸光度(Amax)：在96孔酶標板微孔中加入200 μL PPP，再加入樣品100 μL，PPP調零，用MK3型酶標儀以相同波長測定樣品的Amax值。(3)HSR的計算：HSR=(A15-A0)/(Amax-A0)×100%。

1.3.5準確性試驗[4]按1.3.3同樣方法配制0%、25%、50%、75%、100%的球形PLT懸液,同樣用酶標儀和聚集儀分別檢測HSR，比較球形PLT水平及其與HSR測定值的相關性，以及兩種檢測方法的相關性。

2結果

2.1兩種方法HSR檢測結果比較酶標儀法測得HSR為(65±24)%，血小板聚集儀法測得HSR為(69±20)%，差異無統計學意義(t=0.7，P=0.25)。

表1　　兩種HSR檢測方法的重復性比較(n=10，%)

2.3兩種方法檢測HSR的靈敏度比較應用兩種方法分別檢測0%、10%、20%、30%球形PLT懸液,重復10次檢測。分別與球形PLT百分比為0%的溶液比較，酶標法在球形PLT百分比為20%、30%時測得的HSR降低，差異有統計學意義(t值分別為2.228、3.169，P<0.05)；血小板聚集儀法在球形PLT百分比為20%、30%時測得的HSR也降低，差異有統計學意義(t值分別為2.764、3.581，P<0.05)。當球形PLT增加到20%時，兩種方法測得的HSR均開始明顯降低,故兩種方法的檢測靈敏度均為20%。見表2。

表2　　兩種HSR檢測方法的靈敏度

*：P<0.05，與同種方法球形PLT百分比為0%的懸液比較。

2.4兩種方法檢測HSR的準確性及其與PLT水平的相關性用兩種方法分別對0%、25%、50%、75%、100%的球形PLT懸液進行HSR檢測，測得HSR與球形PLT水平呈明顯正相關(酶標儀法：r= 0.959 8；血小板聚集儀法：r= 0.968 4)。兩種方法測得25%、50%、75%、100%球形PLT懸液的HSR比較，差異均有統計學意義(t值分別為1.735、1.799、1.703、1.621，P<0.05)，且兩種方法測得HSR也呈正相關(r=0.987 5)。見表3。

表3　　兩種HSR檢測方法的準確性

*：P<0.05，與相同球形PLT百分比懸液血小板聚集儀法測得HSR比較。

3討論

血小板聚集儀檢測原理有比濁法和電阻法兩種，電阻法適用于全血和血漿檢測，而比濁法僅適用于血漿檢測。比濁法實際就是A值檢測法，酶標儀的檢測原理也是A值檢測。在檢測血漿中PLT的聚集時，如果能用方便快捷的酶標儀代替血小板聚集儀，將會極大地方便檢驗人員。

HSR反映了PLT在低滲環境中因水進入發生變形后又恢復其原有正常形態的能力,在PLT懸液中加入水，懸液即處于低滲狀態，水滲入PLT,PLT的體積隨即發生腫脹，光透射增強；如果PLT功能正常，就能逐出細胞內的水份，其體積又能恢復到正常狀態，于是光的折射率增強，A值降低。PLT這一體積膨脹又恢復的變化是由細胞內一系列的復雜活動和細胞膜離子通道變化及外部刺激所引起。與其他動物細胞一樣，在低滲環境中，PLT通過產生一系列反應使自身體積腫脹后再恢復正常，這主要是通過降低細胞內各種離子的濃度來維持PLT的體積，通常這種反應通過腺苷三磷酸(ATP)來完成。即在低滲溶液中細胞通過滲透吸水作用使水進入，細胞發生腫脹，此時細胞鈣離子(Ca2+)濃度很快下降，Ca2+濃度下降導致細胞ATP的釋放，ATP與G-蛋白-磷脂酶C相連接，而后G-蛋白腺苷酸脫氨酶與Ca2+受體連接，導致細胞膜上鉀離子(K+)、氯離子(Cl-)通道開啟，K+、Cl-同向轉移，K+、氫離子(H+)泵關閉。這一系列信號傳導導致K+、Cl-和水又從細胞內移出，于是細胞的體積又恢復正常[5-6]。檢測HSR就是通過檢測PLT體積膨脹時光透射變強，而PLT體積恢復時光透射又變弱，來評價PLT的體外功能，以細胞反應恢復率表示。PLT在低滲環境中體積膨脹到最大時所需時間約為18 s。應用酶標儀測定HSR時，加入PRP后混勻8 s，再放入酶標儀進行吸光度監測，這段時間大約需要10 s；PLT體積從最大恢復到正常所需時間約為15 min，故檢測時間設定在15 min。值得注意的是，環境溫度對HSR的測定有較大影響，22 ℃保存的PLT懸液在測定前需預溫至37 ℃后再行測定。

本研究結果顯示，酶標儀和血小板聚集儀兩種方法測定HSR無明顯差異，與文獻[6-10]報道的40%～80%結果比較吻合，說明酶標儀是可以用于測定HSR的。酶標儀是實驗室常用儀器，采用酶標儀測定PLT的HSR，其方法簡單，所需樣品少，重復性完全能達到要求，結果準確，檢測迅速，可同時測定多份樣品。對于沒有血小板聚集儀的實驗室，可以選擇用酶標儀進行HSR檢測。

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(收稿日期：2015-10-06)·臨床研究·

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.041

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0670-03