重組人轉化生長因子β1在CHO/dhfr－細胞中的穩定表達和純化

劉春鳳，張　寧，周　婷，王世媛，陳清西*

( 1．廈門大學生命科學學院，福建廈門361005; 2．廈門特寶生物工程股份有限公司，福建廈門361022)

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重組人轉化生長因子β1在CHO/dhfr－細胞中的穩定表達和純化

劉春鳳1，張寧2，周婷2，王世媛2，陳清西1*

( 1．廈門大學生命科學學院，福建廈門361005; 2．廈門特寶生物工程股份有限公司，福建廈門361022)

摘要:構建了含重組人轉化生長因子β1( rhTGF-β1)基因的真核表達載體，并利用陽離子脂質體介導的方法，將構建的表達載體轉染到二氫葉酸還原酶( DHFR)缺陷型哺乳動物細胞CHO/dhfr(－)中，通過氨甲喋呤( MTX)加壓篩選獲得穩定表達重組人轉化生長因子β1的細胞株．于14 L細胞發酵罐進行擴大培養，通過酶聯免疫吸附實驗( ELISA)檢測得表達量在3 mg/L左右．采用親和層析、反相層析及分子篩凝膠層析的方法分離純化，獲得的rhTGF－β1試制品的純度大于97%，得率在25%以上．通過基質輔助激光解析電離化飛行時間質譜( MALDI－TOF MS)測定rhTGF－β1的分子量為25．470 ku，與理論分子量一致．N端蛋白序列分析儀分析其N端氨基酸序列，與理論的氨基酸序列一致．rhTGF－β1具有抑制水貂肺上皮細胞Mv－1－Lu增殖的活性，測定其比活為3．2×107IU/mg，與商品化的rhTGF－β1標準品相當．本研究為進一步規?；苽鋜hTGF-β1奠定了基礎．

關鍵詞:重組人轉化生長因子β1;表達;純化

轉化生長因子β( transforming growth factor－β，TGF－β)是一類具有多種生物學活性的細胞因子，參與調節細胞的增殖、分化、發育和凋亡等多種生命活動［1］．TGF－β亞家族目前報道有6種，分別為TGF－β1、TGF－β2、TGF－β3、TGF－β4、TGF－β5和TGF－β6，它們氨基酸序列之間有70%～80%的同源性［2］．哺乳動物僅有3種，分別為TGF－β1、TGF－β2和TGF－β3，其中TGF－β1在體細胞系中所占比例最高(＞90%)，活性最強．在人體的多項實驗表明，TGF－β1能夠有效抑制多類細胞的增殖，參與了腫瘤發生發展、免疫反應、創傷修復以及細胞間質的形成等各種生理過程［3］．

在大多數細胞中，未成熟的TGF－β1由390個氨基酸組成，在胞內蛋白內切酶的作用下，N端278個氨基酸形成前導肽或潛伏結合多肽( latency－associated peptide，LAP)，C端112個氨基酸為成熟肽．前導肽通過2個半胱氨酸殘基( Cys)鏈間二硫鍵形成二聚體;成熟肽具有9個高度保守的Cys，其中8個Cys相互靠近，形成鏈內二硫鍵，第9個Cys形成鏈間二硫鍵，構成具有生物學活性的二聚體;前導肽與成熟肽被切開后仍以非共價的形式結合，形成一種與受體不能結合的潛在復合物，需通過改變離子強度和pH進行分離，分離后的成熟肽才具有活性［4］．

目前已有的TGF－β1表達系統不夠完善，后續純化也比較復雜，故我們在構建TGF－β1表達載體時，在目的蛋白N端引入鼠血清白蛋白分泌信號肽和His6標簽，以利于TGF－β1的蛋白分泌及后續純化．同時，將TGF－β1前導肽中的Cys33突變為絲氨酸殘基( Ser)以避免影響目的蛋白活性亞基解離，終產品序列與天然蛋白完全一致．pOptiVec－Topo載體(購于Invitrogen公司)通過內部核糖體進入點( internal ribosome entry site，IRES)序列將目的基因和二氫葉酸還原酶( DHFR)基因連接形成雙順反子表達載體，IRES能夠不依賴5'帽子結構而獨立起始翻譯，在轉錄時目的基因和DHFR基因形成同一條mRNA，以共同的效率和比例表達，排除只整合了DHFR基因的假陽性克隆;應用pOptiVec載體穩定轉染時有利于陽性克隆篩選，有氨甲喋呤( MTX)抗性的細胞均為陽性細胞株［5］．

本研究利用基因工程技術，將來源Invitrogen公司的pOptiVec－Topo真核表達載體通過T4連接酶形成閉環的自連載體，然后將TGF-β1基因插入到改造后的pOptiVec真核表達載體中，轉染DHFR缺陷型哺乳動物細胞CHO/dhfr－，通過MTX梯度加壓篩選，獲得穩定表達TGF－β1的細胞株，在TGF－β1表達產物的分離純化等技術環節進行工藝研究，并對終產品的質量進行了相關鑒定，意在為今后規?；aTGF－β1奠定基礎．

1材料和方法

1. 1材料

CHO/dhfr－細胞為ATCC公司產品;大腸桿菌DH5α由本實驗室保存; T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ、NotⅠ和瓊脂糖為Promega公司產品;質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Omega公司產品; KODPlus Neo PCR酶為TOYOBO公司產品; lipofectamineTM2000、Opti－MEMⅠ培養基購于Invitrogen公司;次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷( hypoxanthine、thymidine，HT)和MTX為Sigma公司產品;杜爾伯科改良依格爾培養基( DMEM)、胰酶和磷酸鹽緩沖液( PBS)為Hyclone公司產品;人TGF－β1鉑酶聯免疫吸附實驗( ELISA)試劑盒購買于eBioscience公司;丙烯酰胺為Promega公司產品;螯合瓊脂糖凝膠FF、SOURCE 15S和葡聚糖凝膠G－25粗填料為General Electric( GE)公司產品;重組人TGF－β1( rhTGF－β1)標準品為R＆D公司產品，其余均為國產或進口分析純試劑．

主要儀器: NBS型14 L細胞發酵罐，B．Braun Biotech公司; 311型CO2培養箱，Thermo公司;全溫振蕩器，型號HZQ－F，哈爾濱東明醫療器械廠;離心機，型號Avanti J－E，Beckman公司; P2B005A01超濾膜，Millipore公司;蛋白純化儀，型號Basic 100，GE公司;基質輔助激光解析電離化飛行時間質譜( MALDI－TOF MS)，型號REFLEXTMⅢ，Bruker公司; N端蛋白序列分析儀，島津公司; SpectraMan M2e酶標儀，Molecular Devices( MD)公司．

1. 2 rhTGF-β1真核表達載體的構建

根據人TGF－β1的氨基酸序列( NM_000660)，采用真核細胞喜好密碼子，按照三聯體密碼原則編排出TGF-β1 cDNA序列．交由捷瑞基因公司合成TGF-β1全基因，插入pGH質粒中．根據標準DNA重組技術構建真核表達質粒，于37℃分別對TGF-β1基因擴增產物和改造后真核表達載體pOptiVec進行BamHⅠ、NotⅠ雙酶切，純化回收酶切產物，并在T4連接酶作用下4℃過夜使表達載體與目的片段連接，連接產物取10 μL轉化DH5α感受態細胞，涂布于LB/Amp抗性平板，37℃培養過夜．挑取單菌落接種于5 mL LB/Amp抗性液體培養基，37℃，220 r/min培養過夜．使用質粒小提試劑盒提取質粒，BamHⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定，經雙酶切初步篩選的陽性克隆進行核酸測序，測序驗證無誤的質粒用于穩定轉染．

1. 3重組質粒DNA的大量制備及穩定轉染CHO/dhfr－細胞株

將包含驗證無誤的質粒pOptiVec/TGF-β1的DH5α菌株接種到一定量的LB/Amp抗性液體培養基中，37℃220 r/min培養過夜．次日，采用無內毒素的質粒提取試劑盒制備得到質粒pOptiVec/TGF-β1，紫外分光光度儀測定所得質粒的濃度和純度．獲得的重組質粒用于穩定轉染CHO/dhfr－細胞株．轉染前24 h，將CHO/dhfr－細胞以2×106接種6孔板，轉染當天確認細胞匯合度介于90%～95%．轉染試劑采用陽離子脂質體lipofectamineTM2000，按照質粒:轉染試劑=1∶3的比例取質粒和轉染試劑先分別與Opti－MEMⅠ培養基混合，體積各100 μL．然后將兩者混合，室溫放置15 min，添加800 μL Opti－MEMⅠ培養基輕輕混勻，加入到細胞中，培養4 h后即可更換完全培養基( DMEM+ 10%(質量分數)胎牛血清白蛋白( FBS) +HT+10－6MTX培養基)．

1. 4穩定表達rhTGF-β1細胞株的篩選

轉染24 h后分板，按照每孔100個細胞鋪96孔板20塊，MTX初始加壓濃度為100 nmol/L，后每輪濃度提高一定倍數．每步加壓前均先亞克隆化，ELISA選擇高表達亞克隆株進行下一步加壓．加壓過程中細胞采用6孔板或T25方瓶培養，加壓時細胞按匯合度為20%～30%鋪板，細胞長滿后傳代2～5次，待細胞適應該篩選壓力、無細胞凋亡且增殖速度正常視為一輪加壓完成，一般需2周左右．通過計算pg/cell/day( PCD)評價加壓前后rhTGF－β1表達是否提高．加壓前和加壓后細胞均按1×105mL－1，2 mL接種于6孔板，培養2 d后取上清，采用ELISA檢測rhTGF－β1表達量，計算rhTGF－β1的PCD值．PCD有提高的細胞株保種并繼續下一輪MTX加壓，共進行3輪．

1. 5 rhTGF-β1的純化

轉染有rhTGF－β1表達質粒的CHO/dhfr－細胞株使用14 L細胞固定床發酵罐發酵表達rhTGF－β1，采用無血清培養基培養，收集培養液上清，離心收集發酵上清．

1. 5. 1膜包超濾

取離心發酵上清，6 ku膜包超濾濃縮，400 mL超純水置換4次，再用含50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris－HCl( pH 8．0)的緩沖液置換4次，收集超濾樣品．

1. 5. 2 Ni柱捕獲

選擇螯合瓊脂糖凝膠FF填料，將超濾后樣品3∶1加入含100 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris－HCl ( pH 8．0)的洗脫緩沖液混勻上樣，再用300 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris－HCl( pH 8．0)洗脫，收集目的樣品．

1. 5. 3 G25柱脫鹽

選擇葡聚糖凝膠G－25粗填料，將Ni柱洗脫樣品上樣，用含1 mol/L NaCl，100 mmol/L甘氨酸( pH 4．0)的緩沖液置換，收集目的樣品，以稀鹽酸調節pH 至3．0，4℃保存過夜．

1. 5. 4反向柱純化

選擇SOURCE 15S填料，將G－25柱洗脫樣品上樣，以30%洗脫緩沖液平衡后，50%洗脫緩沖液洗脫，收集目的樣品．上樣緩沖液為100 mmol/L NaCl、2%乙腈，洗脫緩沖液為0．3%乙酸、70%乙腈．

1. 5. 5 G-25柱脫鹽

選擇葡聚糖凝膠G－25粗填料，將反相柱洗脫樣品上樣，用含150 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘氨酸( pH 4．0)的緩沖液置換，收集目的樣品，凍存于－70℃．

1. 6 rhTGF-β1的鑒定

1. 6. 1質譜法測定分子質量

采用MALDI－TOF MS測定rhTGF－β1分子質量，基質為α－氰基－4－羥基肉桂酸(α－cyano－4－hydroxy－cinnamic acid，HCCA，C10H7NO3，相對分子質量為189．17)．

1. 6. 2氨基酸序列分析

采用Edman降解法測定rhTGF－β1的N端15個氨基酸序列，N端蛋白序列分析儀自動顯示測序峰．

1. 6. 3生物學活性檢測

將收集的培養液上清通過1．5小節所述的純化手段獲得高純度的rhTGF－β1樣品，水貂肺上皮細胞以2 ×105/mL鋪板，體積100 μL，細胞稀釋培養基與樣品稀釋培養基均為DMEM+1%FBS，rhTGF－β1標準品和樣品均以50 ng/mL上板，2．5倍梯度稀釋，共10個梯度．樣品與細胞共培養48 h，加入3－( 4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽( MTT)溶液20 μL，37℃放置4 h，加入150 μL細胞裂解液吹打混合均勻，于酶標儀讀取570 nm和630 nm吸光值．根據樣品生物學活性=E×( C1/C)×( D1/D) (其中，E為標準品效價( IU/ mL)，D1為樣品預稀釋倍數，D為標準品稀釋倍數，C1為樣品半效稀釋度，C為標準品半效稀釋度)，計算rhTGF－β1的生物學活性．

2結果

2. 1重組質粒pOptiVec/TGF-β1的構建和鑒定

將pGH－TGF－β1質粒(本實驗室構建)和改造型pOptiVec載體分別用BamHⅠ、NotⅠ進行雙酶切，回收連接，獲得重組質粒pOptiVec/TGF-β1，轉化DH5α感受態細胞，挑取3個單克隆，擴大培養后通過BamHⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定，經鑒定均為陽性克隆(圖2)，證明TGF-β1片段已經成功插入到pOptiVec載體中．取2號質粒測序，結果與預期相符．

圖2陽性克隆酶切鑒定電泳圖譜Fig．2 Positive colony verification by restriction enzyme digestion

2. 2 rhTGF-β1穩定表達細胞株的獲得

初期篩選均采用不含HT的DMEM+10%FBS培養基，37℃，5% CO2培養箱中靜置培養2周左右開始，在顯微鏡下觀察可以陸續看到明顯的細胞克隆形成;同時，未轉染rhTGF－β1表達質粒的CHO/dhfr－細胞由于缺乏次黃嘌呤( hypoxanthine)、胸腺嘧啶( thymidine)的外部供給已經全部死亡．共進行了3次MTX加壓篩選，梯度依次為100，1 000和2 000 nmol/L．最后獲得2株穩定表達TGF－β1的細胞株．

2. 3 rhTGF-β1的純化及終產品的純度

依據目的蛋白得率、純度、工藝穩健性等指標確定rhTGF－β1純化工藝路線．rhTGF－β1發酵上清經各步層析，目的峰均能與雜質峰有效分離，通過4步純化，得率＞25%．

經多步純化獲得的rhTGF－β1采用SDS－PAGE法測定樣品電泳純度．由于rhTGF－β1是同源二聚體，純化樣品分別用和不用二硫蘇糖醇( DTT)還原處理，上樣量5 μg( 100%)，控制樣品分別上樣150 ng( 3%)、50 ng( 1%)，電壓100～200 V，銀染，掃描分析電泳結果(圖3)．電泳分析顯示，純化后樣品經DTT還原處理分子質量在14 ku左右(理論值為12．7 ku)，應為單體的rhTGF－β1;純化后樣品未經DTT還原處理分子質量在30 ku偏下(理論值為25 ku)，應為二聚體的rhTGF－β1．圖中150 ng( 3%)的蛋白條帶亮于目的樣品的雜質帶，說明rhTGF－β1的雜質含量＜3%，即rhTGF－β1的電泳純度＞97%．

圖3 rhTGF－β1純化樣品SDS－PAGE檢測Fig．3 SDS－PAGE analysis of rhTGF－β1 purified sample

2. 4 rhTGF-β1的分子質量及N端氨基酸序列

采用測定MALDI－TOF MS測定rhTGF－β1分子質量為25．470 ku，與理論分子量一致，結果見圖4．

圖4 rhTGF－β1純化樣品質譜檢測Fig．4 Mass spectrum of rhTGF－β1 purified sample by MALDI－TOF MS

經N端氨基酸序列測定，rhTGF－β1樣品N端15個氨基酸殘基序列為ALDTNYXFSSTEKNX(因Cys不能直接觀察到，用X表示)，測序結果與理論的TGF－β1蛋白N端氨基酸序列一致．

2. 5 rhTGF-β1活性的檢測

以R＆D rhTGF－β1為標準品，采用MV－1－Lu細胞抑制法測定純化獲得的rhTGF－β1樣品，四參數回歸計算法處理檢測數據，半數有效劑量( ED50)約為0．5 ng/mL，比活為3．2×107IU/mg，與R＆D標準品活性相當(圖5)，說明通過CHO/dhfr－細胞表達的rhTGF－β1是有活性的．

圖5 rhTGF－β1活性測定曲線Fig．5 Curve of rhTGF－β1 activity test

3討論

本研究中我們構建了pOptiVec/TGF-β1重組質粒．pOptiVec (改造)載體是采用T4連接酶將pOptiVec－Topo載體( Invitrogen公司)自連形成的．與常規使用的真核載體pSV2－dhfr載體比較，pSV2－dhfr載體目的基因和DHFR基因分別由不同的啟動子起始轉錄，穩定轉染篩選的克隆有可能只整合了DHFR基因造成假陽性;應用pOptiVec載體穩定轉染時有利于陽性克隆篩選，有MTX抗性的細胞均為陽性細胞株．

另外，我們采用CHO/dhfr－細胞進行rhTGF－β1的表達，CHO/dhfr－細胞自身缺失DHFR［6］，無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤( hypoxanthine)、胸腺嘧啶( thymidine)和甘氨酸的培養液中才能得以存活．通過目的基因與DHFR基因共轉染，不僅得到在不含上述添加劑的培養基上也能生長的細胞克隆，更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴增到很多的拷貝數才能生存，從而得到抗MTX細胞系，又由于與DHFR基因共轉染的目的基因傾向于同它一起整合到細胞染色體上的同一區域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴增而擴增，我們就得到了能大量表達外源蛋白的細胞克隆，將rhTGF－β1的表達量由常規的μg/L級別提高到mg/L．此外，本研究采用的純化工藝［7］獲得的純化樣品了純度＞97%，得率＞25%，且經質譜、蛋白N端測序鑒定和活性檢測，結果均符合TGF－β1質量標準．

參考文獻:

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Expression，Purification and Bioactivity Assay of Recombinant Human Transforming Growth Factor-β1 in CHO/dhfr－Cell

LIU Chunfeng1，ZHANG Ning2，ZHOU Ting2，WANG Shiyuan2，CHEN Qingxi1

( 1．School of Life Science，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2．Xiamen Amoytop Biotechnique Company，Xiamen 361022，China)

Abstract:By CHO/dhfr(－)efficient expression，recombinant human transforming growth factor－β1 was conducted in a 14 L cell fermentation tank，and the expression quantity reached 3 mg/L．The purity of rhTGF－β1 was more than 97% with column chromatography method，and the yield was above 25%．Additionally，MALDI－TOF MS and N－terminal protein sequence analyzer were used to analyze its molecular weight and N－terminal sequence，and the activity was determined using MV－1－Lu( NBL－7) cell growth inhibition assay．The results showed that rhTGF－β1 activity was more than 3．2×107IU/mg．This study realized the efficient expression of rhTGF－β1 in CHO/dhfr(－)，and the purified rhTGF－β1 sample by our methods were conformed to the standard of "China pharmacopoeia"，which provided the basis for industrialized production of rhTGF－β1．

Key words:transforming growth factor－β1; expression; purification

*通信作者:chenqx@ xmu．edu．cn

基金項目:國家高技術研究發展計劃( 863計劃) ( 2007AA021604)

收稿日期:2015－01－09錄用日期: 2015－02－14

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．012

中圖分類號:Q 356．1

文獻標志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0067－05

引文格式:劉春鳳，張寧，周婷，等．重組人轉化生長因子β1在CHO/dhfr－細胞中的穩定表達和純化［J］．廈門大學學報(自然科學版)，2016，55( 1) : 67－71．

Citation: LIU C F，ZHANG N，ZHOU T，et al．Expression，purification and bioactivity assay of recombinant human transforming growth factors－β1 in CHO/dhfr－cell［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2015，55( 1) : 67－71．( in Chinese)