桑葉抗糖尿病活性成分研究

王　婭，李嘉盈

(天津醫科大學第二醫院藥學部，天津　300211)

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桑葉抗糖尿病活性成分研究

王婭，李嘉盈

(天津醫科大學第二醫院藥學部，天津300211)

摘要：目的研究桑葉抗糖尿病的活性成分。方法桑葉用80%乙醇和水提取。利用硅膠、凝膠等柱色譜及制備液相色譜進行分離，并根據理化性質和有機波譜技術鑒定了化合物的結構，進一步通過測定生物堿類化合物和黃酮苷類化合物對胰島素抵抗的HepG2細胞葡萄糖消耗量來評價其抗糖尿病活性。結果從桑葉中分離鑒定了8個化合物，分別為：1-脫氧野尻霉素(1)，1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol(2)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)，β-谷甾醇(4)， 正三十四烷醇(5),oxyresveratrol(6)，熊果酸(7)，葡萄糖乙醇苷(8)，此外化合物3能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量。結論化合物3具有較強的抗糖尿病活性。

關鍵詞：桑葉；黃酮苷；抗糖尿病活性

桑葉又名鐵扇子，為?？粕?Morus)植物桑(Morusalba)的葉子，本屬植物廣泛分布于我國，約有11種，主要以浙江、江蘇等南方養蠶地區為主[1]。據文獻報道桑屬植物具有降糖、降壓、抗炎和抗病毒等多種生物活性?，F代藥理研究證明桑葉可明顯抑制血糖升高，具有預防和治療糖尿病的作用[2-3]。本文綜合利用凝膠色譜、硅膠柱色譜等方法從桑葉乙醇和水提取物中分別提取分離鑒定了8個化合物，其中包括生物堿類化合物，黃酮苷類化合物和甾體類化合物，此外，我們對從中分離得到的黃酮苷類和生物堿類化合物進行了抗糖尿病活性的初步篩選，結果顯示化合物3具有較強的降糖作用。

1儀器與材料

Bruker AV 400 核磁共振儀 (TMS內標)；氘代試劑 (Aldrich 公司)；全自動酶標板分析儀(美國伯樂公司)；A sahipak GS- 20G H200142，H200143 色譜柱 (25 mm × 500 mm，5 μm)；硅膠 (青島海洋化工廠)；CO2細胞培養箱(熱力公司)；YMC- Pack ODS-A SH-343-5 色譜柱 (20 mm × 250 mm，5 μm)；超凈工作臺(廣州嘉凡)；倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)；所用試劑均為分析純；含酚紅的DMEM培養基(以色列BI公司)；不含酚紅的DMEM培養液 (Hyclone公司)；特級胎牛血清(杭州天杭生物)，青鏈霉素(以色列BI公司)；磷酸鹽緩沖液 (以色列BI公司)；葡萄糖試劑盒(南京建成)；0.25%(含EDTA)胰蛋白酶(以色列BI公司)；二甲基亞砜(Sigma公司)；胰島素(以色列BI公司)；HepG2細胞購自中科院昆明細胞庫。

桑葉采自浙江杭州(2010年10月)，由中南民族大學生命科學院萬定榮教授鑒定，標本 (D20101019) 存放于天津醫科大學第二附屬醫院藥劑科中藥房。

2實驗方法

2.1提取分離取自然晾干的桑葉10.0 kg，搗碎后用80%的乙醇加熱回流提取4次，每次5 h，減壓濃縮提取液，獲得浸膏800 g，用水混懸，依次用正丁醇、水飽和的石油醚和乙酸乙酯進行萃取，最后得到正丁醇提取物56 g，石油醚提取物80 g，乙酸乙酯提取物65 g。桑葉石油醚提取物和醋酸乙酯提取物分別以硅膠柱層析(350 g，100～200目)分離，用石油醚∶乙酸乙酯[10∶1，8∶1，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，100% 乙酸乙酯，乙酸乙酯 (5% 甲醇)，乙酸乙酯 (10% 甲醇)，乙酸乙酯 (30% 甲醇)]和甲醇梯度洗脫，分離得到10個化學組分(A-J)，其中醋酸乙酯層得到3個組分，石油醚層獲得5個組分。

組分D通過凝膠柱層析分離，氯仿∶甲醇(3∶1)洗脫，得到Fr.1,Fr.2和Fr.3，Fr.1通過高效液相色譜的分離純化，從而得到化合物5(5.6 mg)，化合物6(3.7 mg)和化合物7(4.8 mg)；組分E通過凝膠滲透柱層析分離，三氯甲烷∶甲醇(3∶1)洗脫，得到了Fr.1,Fr.2,Fr.3和Fr.4，Fr.4再通過高效制備液相色譜及薄層色譜法分離純化，得到化合物8(4.5 mg)。組分J經過凝膠滲透柱層析分離，三氯甲烷∶甲醇(3∶1)洗脫，得到了Fr.1,Fr.2和Fr.3，Fr.3再反復經過高效制備液相色譜法及萃取分離純化，分別得到化合物3(20.9 mg)，化合物4(11.7 mg)。

桑葉水提取物用水溶解后，過濾后經離子交換樹脂分離，分別得到了酸性部分，堿性部分和兩性部分。由于桑葉水提取物中含有大量的色素，我們對富含生物堿的堿性部分，最開始采用凝膠離子樹脂分離除去色素，從而得到了生物堿類化合物，再經離子交換樹脂分離得到化合物1(11.0 mg)和化合物2(9.6 mg)。

2.2MTT法篩選化合物低細胞毒劑量用含10%胎牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔10 000個細胞接種到96孔板中，每孔體積200 μL，待細胞貼壁后，每孔加入相應濃度的化合物，作用48 h后，每孔加MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，繼續孵育4 h，終止培養，棄去培養上清液，然后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，繼而用酶標儀在490 nm波長下測量吸光度。

抑制率=(1-加藥組OD值/空白組OD值)× 100%。

2.3胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗實驗通過查閱相關文獻[4-5]，我們建立了胰島素抵抗的HepG2細胞模型，將處于對數生長期的細胞消化后，細胞接種的密度為每毫升 105個，鋪在48孔板中。待細胞貼壁后，加入新鮮配制的含有100 nmol·L-1胰島素的DMEM培養基，并設空白對照組，在CO2培養箱中孵育36 h后棄去舊培養液，然后先用pH3.5的不含血清的DMEM培養基洗4次，再用PBS洗2次，換上無血清不含酚紅的培養基37℃孵育24 h后，最后用葡萄糖檢測試劑盒檢測培養基中剩余的葡萄糖含量。以沒有細胞的空白孔為空白對照，計算24 h后各組細胞的葡萄糖消耗量。

3結果

3.1結構鑒定

3.1.1化合物1白色固體，茚三酮反應顯橙黃色，ESI-MS m/z：187[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,D2O)δ:3.72 (1H,dd,J=11.7,3.0 Hz,H-6a)，3.53 (1H,dd,J=11.7,6.3 Hz,H-6b)，3.39 (1H,ddd,J=10.8,9.3,5.2 Hz,H-2) ，3.24 (1H,t,J=9.3 Hz,H-3),3.13(1H,t,J=9.3 Hz,H-4)，3.02 (1H,dd,J=12.3,5.2 Hz,H-1eq),2.44 (1H,ddd,J=9.3,6.3,3.0 Hz,H-5)，2.36 (1H,dd,J=12.3,10.8 Hz,H-1)。13C-NMR (100 MHz,D2O) δ:78.5(C-3)，71.6(C-4)，70.9(C-2)，61.5(C-6)，60.4(C-5)，48.7(C-1)。以上光譜數據與文獻[6]報道基本一致，因此鑒定化合物 1 為1-脫氧野尻霉素。

3.1.2化合物2無色油狀，茚三酮顯紫色，ESI-MSm/z：134[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,D2O)δ:2.81 (1H,dd,J=12.2,3.9 Hz,H-1a),2.96 (1H,m,H-4),3.09 (1H,dd,J=5.8 Hz,12.2Hz,H-1b),3.61(1H,dd,J=6.3 Hz,11.7 Hz,H-5a),3.70(1H,dd,J=4.8 Hz,11.7 Hz,H-5b),3.79(1H,dd,J=3.7 Hz,5.5 Hz,H-3),4.10(1H,m,H-2)。13C-NMR (100 MHz,D2O) δ:53.4(C-4),64.8(C-5),68.1(C-1),80.2(C-2),81.8(C-3)。以上數據與文獻[7]報道基本一致，因此鑒定化合物 2 為1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol。

3.1.3化合物3亮黃色粉末，鹽酸—鎂粉反應呈紅色，三氯化鋁反應在紫外 254 nm下黃色熒光加強，ESI-MS m/z：449.1[M+H]+。1H-NMR(270 MHz,DMSO-d6)δ:12.62(5-OH),6.19(1H,d,J=2.7 Hz,H-6),6.42(1H,d,J=2.7 Hz,H-8),8.03(2H,dd,J=8.1Hz,2.7 Hz,H-2',6'),6.88 (2H,dd,J=8.1 Hz,2.7Hz,H-3',5'),5.39 (1H,J=7.1 Hz,H-1'')。13C-NMR (67 MHz,DMSO-d6) δ:156.2(C-2),133.2(C-3),176.8(C-4),161.2(C-5),98.7(C-6),164.0(C-7),93.5(C-8),156.1(C-9),103.7(C-10),120.7(C-1'),130.8(C-2'),115.1 (C-3'),159.9 (C-4'),115.1 (C-5'),130.8 (C-6'),100.6 (C-1''),74.1(C-2''),76.5(C-3''),69.8(C-4''),77.3(C-5''),61.2(C-6'')。以上數據與文獻[8]報道一致，因此鑒定化合物3為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3.1.4化合物4無色方晶(乙酸乙酯)，mp：137～138℃，其中IR光譜與β-谷甾醇一致，與β-谷甾醇標準品共TLC，Rf值相同，混合熔點不下降，通過參考文獻[9]，因此該化合物鑒定為β-谷甾醇。

3.1.5化合物5白色粉末，mp：79～81℃。IR (KBr)：3418 cm-1，2919 cm-1，2850 cm-1，1467 cm-1，1176 cm-1，724 cm-1，1H-NMR (CDCl3,400 MHz) δ:0.87 (3H,t,H-34),1.49 (1H,s,OH),3.63(2H,t,H-1)，其他質子1.00～1.70，以上數據與文獻[10]報道一致，因此確定化合物5的結構為正三十四烷醇。

3.1.6化合物6白色結晶，mp：199～200℃，ESI-MS m/z：245[M+H]+。IR (KBr)：3359 cm-1，1614 cm-1，1521 cm-1。1H-NMR (CD3COCD3,300 MHz) δ:7.38(1H,d,J=8.5Hz,H-6),7.32 (1H,d,J=16.5 Hz,H-β),6.87 (1H,d,J=16.5 Hz,H-α),6.50 (2H,d,J=2.5 Hz,H-2',6'),6.42(1H,d,J=2.5 Hz,H-3),6.36(1H,dd,J=8.5,2.5 Hz,H-5),6.22 (1H,t,J=2.5 Hz,H-4')。13C-NMR (75 MHz,CD3COCD3) δ:158.7 (C-3',5'),158.4(C-4),156.1 (C-2),140.9 (C-1'),127.6 (C-β),125.7 (C-α),122.9 (C-6),116.5 (C-1),107.8 (C-5),104.8(C-2',6'),101.9(C-4'),101.5(C-3)。以上數據與文獻[11]報道一致，因此確定化合物為oxyresveratrol。

3.1.7化合物7白色粉末(CHCl3),mp：272～273℃，Liebermann-Burehard反應呈陽性。1H-NMR (CDCl3,300 MHz) δ:5.47(IH,t,J=7.5 Hz,H-12),1.20,1.12,1.02,1.00,0.98,0.87和0.83為7個甲基信號。13C-NMR (CDCl3,75 MHz) δ:39.3(C-1),28.4(C-2),78.0(C-3),39.7(C-4),56.5(C-5),33.5(C-6),19.1(C-7),39.7(C-8),48.3(C-9),37.7(C-10),23.9(C-11),125.7(C-12),139.3(C-13),42.8(C-14),29.2(C-15),24.2(C-16),48.1(C-17),53.5(C-18),40.2(C-19),39.5(C-20),30.2(C-21),37.2(C-22),29.0(C-23),16.0(C-25),16.9(C-25),17.7(C-26),25.1(C-27),179.8(C-28),17.9(C-29),21.7(C-30)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物7為熊果酸。

3.1.8化合物8白色粉末，mp：140～142℃。1H-NMR (CD3OD，500 MHz) δ:4.5 (1H,d,J=8.0Hz)為糖端基質子信號，此糖為 β 構型。4.04(1H,m),3.94 (1H,dd,J=12.2,1.8 Hz),3.65(2H,m),3.49(2H,m),3.42(1H,t,J=9.4 Hz),3.31(1H,t,J=9.3 Hz)為糖上6個H和連糖乙基2個H。1.25(3H,t,J=7.2 Hz)為和亞甲基相連的甲基信號。13C-NMR(CD3OD,500 MHz)δ:104.2(Glc-C-1),78.3(Glc-C-5),78.2(Glc-C-3),75.5(Glc-C-4),72.0(Glc-C-2),68.5(-CH2CH3),63.2(Glc-C-6),16.6(-CH2CH3)。以上數據與文獻[13-14]報道一致，因此鑒定化合物 8 為葡萄糖乙醇苷。

3.2MTT實驗結果本文測定了化合物1～3對人肝癌細胞HepG2的細胞毒性，結果如表1所示，化合物1～3在10 μmol·L-1和50 μmol·L-1濃度下對人肝癌細胞HepG2的增殖均無顯著性的影響。

表1　化合物1～3對HepG2細胞的生長抑制率(n= 3)

注：*與對照組相比,P<0.05；**對照組相比,P<0.01。

3.3化合物對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響本文對分離得到的生物堿類和黃酮苷類化合物在非細胞毒劑量下進行了抗糖尿病活性的初步篩選，以胰島素抵抗的HepG2細胞為體外模型測定了化合物1～3在非細胞毒劑量下對該細胞葡萄糖消耗的影響，從表2可以看出，化合物1～3都能夠明顯增加胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗量，且存在一定的劑量依存性。

表2　化合物1～3對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響(n= 3)

注:**與IR模型組相比,P<0.01。

根據前面初步篩選的結果，從而確定了測定EC50的濃度范圍，進一步對化合物1～3進行了EC50濃度測定，結果見表3。

表3　化合物1～3對胰島素抵抗HepG2細胞

4討論

本文從桑葉石油醚和乙酸乙酯部位分別提取分離得到了6個化合物，從水提取物中分離得到了2個化合物。以胰島素抵抗的HepG2細胞為模型，對化合物1～3進行了抗糖尿病活性的初步篩選，初步篩選結果表明，黃酮苷類化合物3能夠顯著提高HepG2細胞的葡萄糖消耗量，能夠改善HepG2細胞胰島素抵抗癥狀，加強細胞對葡萄糖的攝取利用，顯示了明確的體外抗糖尿病活性。以上研究為中藥桑葉的現代應用提供了實驗依據，為抗糖尿病新型藥物的發現提供了基礎。

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Anti-diabetic constituents of mulberry leaf

WANG Ya，LI Jia-ying

(DepartmentofPharmacy,SecondHospitalAffiliatedtoTianjinMedicalUniversity，Tianjin300211,China)

Abstract:Objective To study the chemical constituents and their anti-diabetic activity from the mulberry leaf.Methods Extracted with 80% ethyl alcohol and water,the constituents were isolated by chromatography of silica gel,ODS and p-HPLC,whose structures were identified on the basis of the physical properties and spectral analysis. Furthermore，glucose consumption assays in insulin-resistance HepG2 cells were used to assay the anti-diabetic activity of flavonoid glycosides and alkaloids.Results Eight compounds were isolated from mulberry leaf and identified as 1-deoxynojirimycin(1),1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol(2),Kaemperol -3-O- β-D- glucopyranoside(3),β-stigmasterol (4),n-tetratriacontanol (5),oxyresveratrol (6),ursolic acid (7),ethyl-β-D-glucopyranoside(8) and compound 3 significantly stimulated glucose consumption and phosphorylation of Akt in insulin resistance HepG2 cells.Conclusions Compound 3 exhibits excellent anti-diabetic activity.

Key words:mulberry leaf;flavonoid glycoside;anti-diabetic activity

(收稿日期：2015-10-18，修回日期：2015-11-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.005