卵巢癌組織中microRNA-7表達水平及其臨床意義

焦麗敏，梁　進，王　瓊，李紀強

(1. 佛山市南海區第六人民醫院婦科，廣東 佛山　528200；

2.南方醫科大學珠江醫院腫瘤中心，廣東 廣州　510282)

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卵巢癌組織中microRNA-7表達水平及其臨床意義

焦麗敏1，梁進1，王瓊1，李紀強2

(1. 佛山市南海區第六人民醫院婦科，廣東 佛山528200；

2.南方醫科大學珠江醫院腫瘤中心，廣東 廣州510282)

摘要：目的探討microRNA-7在卵巢癌組織中的表達水平及其臨床意義。方法收集該院確診的卵巢癌患者42例，每例均行手術切除。同時收集38例良性卵巢上皮囊腫組織作為良性對照組。采用RT-PCR方法分別檢測卵巢癌組織、癌旁組織和良性病變組織樣本microRNA-7的表達，并分析其表達與卵巢癌臨床特征的關系。結果卵巢癌組織microRNA-7表達為0.176±0.063，癌旁組織表達為0.314±0.099，良性病變組織表達為0.465±0.123。與癌旁組織和良性病變組織比較，卵巢癌組織中microRNA-7 表達顯著下降(P均<0.05)。microRNA-7的表達與患者的年齡、病理分型無關，與臨床分期和區域淋巴結轉移相關(P均<0.05)。單因素分析結果顯示，microRNA-7高表達的卵巢癌病人總生存期長于低表達組(P=0.02)。結論 microRNA-7在卵巢癌組織中表達下顯著調，可能是卵巢癌患者重要的預后指標之一。

關鍵詞：卵巢癌；微小RNA；microRNA-7；RT-PCR

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，據最新統計，在全球范圍內，卵巢癌在婦科腫瘤中發病率居于第3位，而死亡率居于第1位[1]。卵巢癌對于放、化療敏感性較差，且能夠進行根治性手術治療的患者比例較低，因此卵巢癌患者總體預后不良[2]。在目前治療方法尚未取得突破性進展以前，尋找評估卵巢癌預后的可能指標對于提高卵巢癌治療效果具有重要意義。

研究發現，microRNA在惡性腫瘤的診斷和預后評估中發揮越來越重要的作用，microRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與mRNA完全或不完全配對，通過降解mRNA或阻遏其轉錄后翻譯的調節機制，發揮其獨特的負調控基因表達的能力。microRNA-7是一種具有抑癌作用的microRNA，在結直腸癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤組織中顯著低表達，具有良好的評估診斷和預后的作用[3-5]。但在卵巢癌組織中尚未見文獻報道，本文擬檢測卵巢癌組織、癌旁組織和良性病變組織中microRNA-7的表達，并探討其與卵巢癌臨床特征之間的關系。

1材料與方法

1.1標本來源收集本院婦科2011年1月至2012年1月經過病理組織學確診的42例卵巢癌患者的腫瘤標本和癌旁標本。在取得標本時，均未進行手術或放化療，最終，所有納入患者均經過術后病理學并影像學確認。收集本院2011年1月至2012年1月經過病理組織學確診的38例卵巢上皮囊腫組織作為良性對照組。

1.2主要試劑與儀器RNA抽提試劑盒(Qiagen，GER)，RT-PCR反應試劑盒、dNTPMix、RNasin (TaKaRa公司)，microRNA-7的特異性莖環引物和探針(Ambion, USA)，U6B的特異性莖環引物和探針(Ambion，USA)。儀器：V 22000型紫外分光光度計(上海尤尼可儀器有限公司)，移液器(Eppendorf，GER)；低溫高速離心機購自(Beckman, USA)，7900型定量PCR儀(ABI, USA)。

1.3實驗方法

1.3.1組織標本總RNA提取按照RNA提取試劑盒說明書提取組織中的microRNA。RNA，紫外分光光度計測RNA濃度及純度，取吸光值(A)比值為1.8～2.1的樣品用于后續試驗。

1.3.2qRT-PCR檢測microRNA-7 表達采用SYBR green法檢測microRNA-7的表達水平，選用U6snRNA作為內參。定量PCR儀進行qRT-PCR，將所有cDNA樣品分別配置qRT-PCR反應體系，體系配置如下：逆轉錄產物2 μL，10×PCR緩沖液1 μL，PCR特異引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL，MgCl2溶液0.6 μL，0.5 U Taq聚合酶0.2 μL，2 ×ROX Reference Dye 0．2 μL，加水至總體積為8 μL。反應條件：95 ℃ 3 min活化Taq聚合酶；40個PCR循環(95℃ 15 s；60 ℃ 20 s；72℃ 20 s；78℃ 20 s)。擴增反應結束后，并從60℃緩慢加熱到99℃。采用Primer 5．0軟件設計microRNA特異性引物。采用2-△Ct法計算組織中microRNA-7水平?！鰿t=Ct(microRNA-7)-Ct(U6)，每個樣本設立3個平行管。

1.4生存期隨訪隨訪截止于2015年1月1日，采用電話隨訪，隨訪率為92.86%?？偵嫫趶拇_診日期至死亡或隨訪截止日期。

1.5統計方法應用SPSS14.0對實驗數據進行統計學處理。計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，生存期分析采用Kaplan-Meier法，兩組生存比較為Logrank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1microRNA-7分別在卵巢癌組織、癌旁組織和良性病變組織樣本中表達情況卵巢癌組織microRNA-7表達為0.176±0.063，癌旁組織表達為0.314±0.099，良性病變組織表達為0.465±0.123。與癌旁組織和良性病變組織比較，卵巢癌組織中microRNA-7 表達顯著下降(P均<0.05)。

2.2卵巢癌組織中microRNA-7表達水平和臨床病理特征之間的關系microRNA-7在卵巢癌患者組織中的表達與年齡和病理類型無關，與臨床分期、分化程度及淋巴結轉移有關。臨床分期為Ⅲ級、Ⅳ級的患者，microRNA-7表達水平較低；低分化程度或(和)淋巴結轉移的microRNA-7水平降低，差異均有統計學意義(P<0．05)。見圖1。

2.3卵巢癌患者組織microRNA-7表達水平和生存期之間的關系截止至隨訪時間，42例患者中有25例存活，全組中位總生存時間為29.9個月。microRNA-7高表達組中位總生存時間為40.5個月，明顯高于microRNA-7低表達組的22.7個月(LOGRANK檢驗P=0.02)，見圖2。

3討論

目前臨床中應用的卵巢癌腫瘤標志物主要包括糖類抗原125(cancer antigen 125, CA125)和人附睪蛋白4(human epididymis secretory protein 4, HE4)，二者對于卵巢癌的診斷有一定價值，但對于預測卵巢癌復發及預后存在明顯局限性。進一步尋找能夠有效幫助卵巢癌診斷和預后判定的腫瘤標志物具有重要意義。通過研究腫瘤組織中microRNA表達情況，從而幫助腫瘤的診斷和預后判定在很多腫瘤中已有研究。在前期研究的基礎上，我們發現microRNA-7可能同卵巢癌密切相關。microRNA-7是一個定位在人類基因組3個不同基因位點的內含子miRNA，保守存在于在所有物種之中。研究發現在多種常見惡性腫瘤中miR-7均表達異常，其在惡性轉化和轉移中起著重要的作用。本研究發現：卵巢癌組織中microRNA-7表達顯著下降，并且同卵巢癌較晚臨床分期和轉移等不良預后因素密切相關。這一研究同既往microRNA-7在其他腫瘤病灶中表達相關研究一致，比如microRNA-7在人類乳腺癌、結直腸癌、肺癌等多種腫瘤組織中顯著低表達：有研究采用Real-time PCR技術檢測多種結直腸癌細胞系microRNA-7的表達，發現所有的細胞系的microRNA-7表達均明顯下調，同時發現結直腸癌組織中microRNA-7表達較癌旁組織顯著下調[6]。在乳腺癌組織中microRNA-7的表達較正常乳腺組織顯著下降，并且microRNA-7的表達水平同乳腺癌轉移呈負相關[4]。非小細胞肺癌細胞系A549和 H1299中的microRNA-7表達顯著下調；同時與癌旁組織相比，非小細胞肺癌組織中的microRNA-7表達同樣下調[7]。

圖1　卵巢癌患者組織microRN-7表達和臨床病理特征的關系(*P<0．05)

圖2　microRNA-7高表達和低表達組病人的生存曲線

microRNA在生物體內廣泛存在，在調節細胞增殖、凋亡、分化等重要過程中均發揮重要作用[6,8]，且在物種之間具有高度保守性[9]?；谏鲜鎏卣?，其在惡性腫瘤的發生、發展過程中，起到重要作用。有的發揮原癌基因的作用，有的起到抑癌基因的作用。然而microRNA主要參與轉錄后基因表達調控，即是通過不完全互補結合到目標靶mRNA 3’非編碼區端，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，阻斷mRNA的翻譯，發揮其獨特的負調控基因表達的能力。microRNA-7通過何種途徑參與卵巢癌發生、發展，至今尚未有明確結論。然而，在其他腫瘤中已經有研究進行了初步的探討。有研究采用生物信息學在乳腺癌組織中分析預測microRNA-7的靶基因，共有114個靶基因被預測出[4]，進一步對這些靶基因進行功能學分析發現，這些靶基因的功能與腫瘤細胞的生長、轉移等密切相關。值得注意的是，microRNA-7對腫瘤細胞的生物學效應是通過作用于細胞內多個靶點甚至整個信號調節網絡產生的。在研究開始過程中僅研究一個或數個靶點，但在分析其在細胞的生物學行為方面的作用時應綜合考慮。

本研究初步發現microRNA-7可以有助于卵巢癌患者預后的判斷，microRNA-7在卵巢癌組織中高表達患者的生存期長于低表達者。目前在包括卵巢癌在內的多種腫瘤組織中檢測的許多microRNA均有類似結論，比如在細胞水平microRNA-129-5p可以抑制卵巢癌細胞的生長和存活時間，起到抑癌作用[10]，microRNA-126在體內具有抑制結腸癌細胞增殖及侵襲轉移，microRNA-19則可以促進非小細胞肺癌的轉移，且可能是化療藥物的作用靶點。在臨床研究中，Delfino等對272例卵巢癌患者的799個microRNA進行檢測，進而分析其與卵巢癌患者生存期和復發的關系，發現3個microRNA(hsa-miR-16, hsa-miR-22*, and ebv-miR-BHRF1-2)同卵巢癌復發和生存期顯著相關[11]。microRNA-7的功能學認識目前被基本認為一個抑癌基因：既可以通過直接作用于重要靶基因而影響細胞黏附、遷移、侵襲、遠處轉移以及上皮間質轉化等重要生物學過程，進而影響腫瘤的進展；又可以通過促進腫瘤對藥物治療的敏感性、抑制腫瘤血管生成等方面間接發揮抑癌作用。但microRNA-7在卵巢癌中的研究尚少見到[12-16]。本研究因為研究設計問題未能進行復發情況分析。同時由于研究時間所限，本研究納入的例數較少，可能需要進一步擴大樣本量進行分析。

綜上所述，卵巢癌病人組織中microRNA-7表達水平顯著下降，且其下降與不良臨床特征有關，且在卵巢癌預后評估中有一定的價值，可用于輔助卵巢癌的預后評估。

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Expression and clinical significance of microRNA-7 in tissue of ovarian cancer patients

JIAO Li-min,LIANG Jin,WANG Qiong,et al

(DepartmentofGynecology,The6thPeople’sHospitalofFoshan，NanhaiDistrict,Foshan,

Guangdong528200,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the expression of microRNA-7 in tissue of ovarian cancer patients and to analyze the relationship between microRNA-7 and clinical features. Methods We enrolled 42 ovarian cancer patients and 38 controls with benign ovarian epithelial cyst in the study. By the reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-qPCR), the expression of microRNA-7 was detected in tumor tissues, paracancerous tissues and benign tissues. Results Compared with the controls, microRNA-7 in the tissues of ovarian cancer patients was significantly reduced (P<0.05). The expression of microRNA-7 in the tissues of ovarian cancer patients was not related to the age or pathological type, but to the clinical stage and metastasis (P<0.05). The patients with high microRNA-7 expression had better overall survival than the patients with low microRNA expression. Conclusion The expression of microRNA-7 in tissues of ovarian cancer patients is down regulated, which may become an important prognostic indicator for ovarian carcinoma.

Key words：ovarian carcinoma;microRNA;microRNA-7;RT-PCR

(收稿日期：2015-09-17，修回日期：2015-11-03)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.025

通信作者：李紀強，男，副主任醫師，研究方向：microRNA在惡性腫瘤生長及轉移中的作用，E-mail:banlangen12@163.com

基金項目：國家自然科學基金(No 81503526)