HPLC測定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量

袁學剛，王戰國，胡慧玲，楊向東，鄒亮，余騰江，4，劉巧

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HPLC測定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量

袁學剛1，王戰國2，胡慧玲3，楊向東1，鄒亮2，余騰江1，4，劉巧3

[摘要]目的：建立快速測定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的HPLC方法。方法：色譜柱為ChromstarTM C(18)色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-含0.1 ％三乙胺和0.1 ％甲酸的水溶液（30:70，V/ V）；檢測波長345 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL．min(-1)。進樣量20 μL。結果：連梔礬溶液樣品中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿在12 min 內達到分離，峰形尖銳對稱。鹽酸小檗堿在 2.82～44.91 μg．mL(-1)范圍內線性關系良好，平均加樣回收率為97.95％。七批次連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿含量以鹽酸小檗堿計，分別為0.126 ± 0.019，0.167 ± 0.029，0.140 ± 0.018和0.618 ± 0.079 mg．mL(-1)。結論：建立的HPLC方法高效、準確，經濟，精密度好，靈敏度高，可用于連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的同時快速測定分析。

[關鍵詞]高效液相色譜；連梔礬溶液；表小檗堿；黃連堿；巴馬??；鹽酸小檗堿

[作者單位]1.成都肛腸?？漆t院，四川 成都 610037；2.成都大學醫學院（護理學院），四川 成都 610106；3.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；4.瀘州醫學院附屬中醫院，四川 瀘州 646000

“連梔礬溶液”出自我國著名中醫肛腸病學專家黃濟川先生的臨床效驗方，為成都肛腸?？漆t院的醫院效驗制劑（川藥制字Z 20080191）。制劑由黃連、梔子、白礬等藥組成，經古法工藝制備而成，常用于慢性潰瘍性直腸炎[1-4]、肛漏[5]、肛門墜脹[6-7]、肛周膿腫[8-10]和肛門尖銳濕疣[11]等肛腸科疾病的臨床治療和預防，且療效顯著。鑒于該醫院制劑的現有質量控制方法僅僅采用薄層色譜法開展黃連藥材的定性控制，迫切需要開展定量質量控制分析研究，以保障醫院制劑的質量。本文采用高效液相色譜法（HPLC）進行制劑中的鹽酸小檗堿及相關成分的含量測定方法研究，研究結果可為連梔礬溶液質量控制提供參考。

1　儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀（HPLC），包括4元泵系統、全自動脫氣單元、VWD 檢測器單元和Agilent 1100 色譜工作站等（Agilent Techologies，USA）；SB-300 DTY型數控超聲儀（寧波新芝生物科技有限公司）；WSD-II型超純水系統（成都威思達智能科技有限公司）。

鹽酸小檗堿（98.14％，NO.0713-9906），購自中國藥品食品檢定研究院；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。7批次連梔礬溶液（批號為：20120201，20121001，20121101，20130201，20131001，20131101，20131201）由成都肛腸?？漆t院提供。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱，ChromstarTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-水（每1000mL含1mL三乙胺，1mL甲酸）為30:70（V/V）；檢測波長為345 nm；流速：0.8 mL．min-1，柱溫：30℃。

2.2對照品儲備溶液的制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定（5.72mg），置于50 mL棕色量瓶中，加入甲醇約45 mL，超聲處理 15 min（100 Hz），室溫放置10 min后用甲醇定容至刻度，得鹽酸小檗堿對照品儲備溶液（112.272 μg．mL-1）。

2.3供試品溶液的制備

將7批不同批號（YP1-YP7）的連梔礬溶液（n=3），分別精密量取連梔礬溶液0.5 mL，置入25mL棕色量瓶中，加入甲醇定容至25 mL，稱定質量，超聲處理15 min（100 Hz），放置冷卻后，用甲醇補足重量，分別用1mL樣品溶液過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4線性關系考察

精密量取對照品儲備溶液4 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得1號對照品溶液（S1）；采用倍數稀釋法，精密量取S1對照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得2號對照品溶液（S2）；精密量取S2對照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得3號對照品溶液（S3）；按上法，依次獲得S4～S5。S1-S5對照品溶液分別過 0.2 μm 微孔濾膜后，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜峰。以色譜峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y＝88.243 X＋43.48，r＝0.9999；鹽酸小檗堿在 2.82～44.91 μg．mL-1濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5系統適應性考察

選擇3號對照品溶液（S3），連梔礬溶液供試品溶液（樣品4，生產批號：20130201），按上述色譜條件進樣分析，記錄其色譜圖（圖1）。鹽酸小檗堿峰形尖銳對稱，保留時間約為9.5 min，與其他色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數大于5000，拖尾因子符合分析要求，供試品溶液中其它物質不干擾鹽酸小檗堿的測定。同時表小檗堿、黃連堿和巴馬汀與鹽酸小檗堿的相對色譜峰位置如圖1所示，分別由峰2，3和4表示。

圖1　供試品溶液（YP4-1）和對照品溶液(S3)的HPLC色譜圖

2.6精密度試驗

選擇對照品溶液（S3），按上述色譜條件進樣測定，分別連續進樣 5 次，記錄色譜圖，記錄鹽酸小檗堿峰面積數據，其峰面積的RSD為3.23％，表明精密度良好。

2.7穩定性試驗

取樣品1溶液，在室溫（21 ℃）條件下分別于0，4，8，16，24 h 按上述色譜條件進樣測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積數據，其峰面積的RSD為3.76 ％，表明供試品溶液在24 h內的穩定性較好。

2.8重現性試驗

取樣品1，按供試品溶液制備方法，平行制備供試品溶液5份，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，記錄鹽酸小檗堿的峰面積，計算得鹽酸小檗堿的含量為0.735 ± 0.033 mg．mL-1，鹽酸小檗堿含量的RSD為4.48 ％，表明方法的重現性良好。

2.9加樣回收率試驗

取重現性用試驗樣品1共5份，每份精密吸取0.25 mL，分別精密加入S1號鹽酸小檗堿對照品溶液溶液4mL (179.63 μg)，按照“2.3 供試品溶液的制備”項下制備樣品，按上述色譜條件進樣測定，計算鹽酸小檗堿含量。加樣回收率按如下公式計算，即（測得含量-已知樣品中的含量）/加入對照品量×100％，結果顯示，鹽酸小檗堿的平均回收率為 99.49 ％，RSD為2.33 ％，表明方法加樣回收率符合要求。

2.10樣品含量測定

采用所建立的HPLC方法分別測定7批連梔礬溶液中鹽酸小檗堿的含量及表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的相對含量，結果見表1。

表1　連梔礬溶液中的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量測定結果(n＝3)

含量測定結果表明，7批連梔礬溶液樣品中鹽酸小檗堿的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量未見明顯差異，表明7批次樣品的質量差異不顯著。生產批次靠后的樣品7的主要成分含量比其他批次略微高些，但不具備統計學差異意義，初步表明樣品的制劑穩定性較好。

3　討論

試驗參照文獻方法[12～13]，以連梔礬溶液中君藥黃連的主要成分鹽酸小檗堿為方法學指標，通過調整流動相組成與比例、檢測波長、流速、柱溫等色譜條件，達到在較短的時間（12 min）內快速分離并測定鹽酸鹽酸小檗堿及其相關成分包括表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量。論文建立的HPLC方法快速、精密度高、重現性好，可用于醫院制劑連梔礬溶液的定量控制，為其臨床療效的發揮提供重要保障。試驗中，通過建立的分析方法，對經一代名醫黃濟川先生的制備方法和技術制備的近2年的“連梔礬溶液”進行包含表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸鹽酸小檗堿等成分的分析研究，結果顯示出成分含量差異不顯著，這在一定程度上表明該醫院制劑制備工藝優良且質量較穩定。

[參考文獻]

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[6]李遠志,楊向東.玄參湯口服合并連梔礬溶液灌腸治療肛門墜脹臨床觀察[J].河南中醫,2013,33(11):2025.

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[11]卿勇,李遠志.超聲刀疣體切除術聯合連梔礬溶液坐浴治療肛門尖銳濕疣34例臨床體會[J].結直腸肛門外科,2012,18 (5):311.

[12]張華,劉敏,李忠東.HPLC法測定芩連平胃湯中小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀含量[J].遼寧中醫藥大學學報,2014, 16(12):56.

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（責任編輯：何瑤）

Quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan Solution by HPLC

YUAN Xuegang1, WANG Zhan-guo2, HU Hui-ling3, YANG Xiang-dong1, ZOU Liang2, YU Teng-jiang1, 4, LIU Qiao3
(1.Chengdu Anorectal Hospital, Chengdu 610037 Sichuan;2.School of Basic Medical Sciences ＆ Nursing, Chengdu University, Chengdu 610106 Sichuan;3.Pharmacy College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611730 Sichuan; 4.Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000 Sichuan)

[Abstract]Objective: To establish a HPLC method for quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution.Method: HPLC separation was performed on a Chromstar TM C(18)column (4.6 mm × 250 mm，5 μm) with 0.8 mL．mL(-1)mobile phase, which consisted of acetonitrile-water (0.1％ triethylamine and 0.1％ formic acid, v/v= 30:70).And the detection was set at 345 nm.Result: Epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution were separated well in 12 min.The linearity range of berberine was 2.82～44.91 μg．mL(-1)with high linear regression constant.The average recovery was 97.95％.The contents of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine of 7 batches Lianzhifan solution were 0.126 ± 0.019, 0.167 ± 0.029, 0.140 ± 0.018, 0.618 ± 0.079 mg．mL(-1).Conclusion: The established HPLC method was efficient, accurate, economical, good precision and high sensitivity.It can be used for rapid quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution.

[Key words]HPLC; Lianzhifan solution; epiberberine; coptisine; palmatine; berberine

[收稿日期]2015-11-11

[通訊作者]王戰國，博士，講師，從事中醫藥代謝組學研究Email:wangzhanguo@scu.edu.cn

[作者簡介]袁學剛，碩士，副主任醫師，從事中醫肛腸病臨床研究 Tel:13880484566Email: 14472543@qq.com

[基金項目]國家自然科學基金青年基金項目(81403178)；四川省科技廳項目(2015SZ0039、2015FZ0045、2013JY0194)；成都市衛生局項目(20140301)

[中圖分類號]R 283.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-926X(2016)01-010-03