一株耐氧耐酸堿高效異養硝化菌的篩選及其硝化特性研究

郝永利，王慶生

(1.環境保護部固體廢物與化學品管理技術中心，北京 100029；2.中國環境科學研究院，北京 100012)

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一株耐氧耐酸堿高效異養硝化菌的篩選及其硝化特性研究

郝永利1，王慶生2

(1.環境保護部固體廢物與化學品管理技術中心，北京 100029；2.中國環境科學研究院，北京 100012)

摘要：通過專一性選擇培養基，從活性污泥中篩選到一株高效異養硝化菌，并對菌株進行了鑒定及硝化特性研究。結果表明，篩選到的異養硝化菌株為芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為GL2。碳源、有機氮源、C/N、溶解氧及初始pH值均對菌株硝化特性有較大影響，在丁二酸鈉為碳源、硫酸銨為氮源、C/N15、DO 3.8～8.5 mg/L及初始pH值為6～10、氨氮負荷為420 mg/L條件下，氨氮去除率達99.7%，顯示出該菌株高效硝化能力。菌株兼具好氧反硝化特性，可實現單級反應器的同步硝化反硝化，具有潛在的工程廢水處理應用價值。

關鍵詞：異養硝化；篩選；16S rDNA序列；硝化特性；去除率

在垃圾滲濾液等高氨氮有機廢水處理過程中，脫氮一直是處理的難點。生物脫氮因具有處理成本低、工藝調試簡單等優點，已被廣泛應用于各類高濃度有機廢水脫氮工藝中。而異養硝化是一類異養微生物在有氧條件下進行硝化脫氮的過程，且異養硝化菌具有生長速度快、環境適應性強等優點[1-2]；因此，異養硝化作為生物脫氮新技術之一，引起了國內外相關研究者的廣泛關注。

目前，一系列異養硝化菌被篩選出來，如木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)、糞產堿菌(Alcaligenes faecalis)等[3-4]；但篩選出的異養硝化菌在實際硝化過程中存在生長活性差、生存能力弱及硝化效率低等問題，如H. Y. Zheng等[5]篩選出的菌株，在硝化反應過程中亞硝酸鹽嚴重積累。另外，研究者們在對篩選出的異養硝化菌進行硝化特性研究時，多以無機氮源作為唯一氮源且氨氮起初負荷較低，因此上述菌株在處理高濃度有機廢水時，其硝化效果存在很大的不確定性。本研究篩選出一株高效異養硝化菌，并對其硝化特性進行詳實的研究，以期為垃圾滲濾液等高氨氮有機廢水的脫氮處理提供理論支持和候選菌株。

1材料與方法

1.1菌株來源

菌株分離自垃圾滲濾液處理活性污泥。

1.2培養基

富集馴化培養基(L-1)：丁二酸鈉·6H2O 23.85 g；(NH4)2SO42.0 g ；維氏鹽溶液50 mL；pH=7.2。

異養硝化培養基(L-1)：同富集馴化培養基。

LB活化培養基(L-1)：蛋白胨 10 g；酵母浸膏 5 g；NaCl 5 g；pH=7。

維氏鹽溶液(L-1)： K2HPO45.0 g； MgSO4·7H2O 2.5 g；NaCl 2.5 g； FeSO4·7H2O 0.05 g； MnSO4·H2O 0.05 g。

1.3異養硝化菌株的篩選

1.3.1菌株的富集、初篩

將5 mL打散的活性污泥轉接至滅菌富集培養基中，經過一段時間的富集馴化培養之后，通過連續稀釋以及平板劃線純化，然后將單菌落轉接到斜面保存。

1.3.2斜面菌株復篩

將前期初篩菌株分別活化并轉接到異養硝化培養基中進行搖床恒溫培養，48 h后取樣測定培養基的氨氮去除率，根據培養基中氨氮去除率確定復篩菌株。

1.4菌株形態學及理化特性

復篩菌株的形態學特征及其理化特性研究可參照文獻[6-7]的方法實施。

1.5菌株16S rDNA序列分析

1.5.1基因組DNA的提取

基因組DNA的提取參考文獻[8]中的CTAB法。

1.5.216S rDNA序列測序

以基因組DNA為模板擴增16S rDNA基因，采用通用引物，常規PCR反應體系進行擴增。PCR擴增產經純化后外送測序。

1.5.3菌株系統發育分析

將測序得到的16S rDNA序列在National Center for Biotechnology Information中進行序列相似性比對，選取多株模式菌16S rDNA序列，使用MEGA軟件進行多序列比對分析，并構建菌株系統發育樹。

1.6異養硝化菌株GL2硝化特性研究

1.6.1碳源對菌株GL2硝化特性的影響

分別以乙酸鈉、檸檬酸鈉及丁二酸鈉為培養基唯一碳源，設置碳氮比(C/N)為10，以體積比為1%的接種量接種到100 mL培養液中，置于30 ℃搖床培養，搖床轉速為180 r/min。培養過程中每隔8 h取樣測定培養基中pH值、OD600及氨氮濃度。

1.6.2C/N對菌株GL2硝化特性的影響

改變培養基中丁二酸鈉的量，將C/N分別調整為2、4、8、10和15，以體積比為1%的接種量接種到培養液中，置于30 ℃搖床培養，搖床轉速為180 r/min。取樣及指標測定同1.6.1節。

1.6.3初始pH值對菌株GL2硝化特性的影響

將培養基中的pH值分別調整為5、6、8、9和10，以體積比為1%的接種量，將菌株轉接至培養液中，置于30 ℃搖床培養，搖床轉速為180 r/min。取樣及指標測定同1.6.1節。

1.6.4DO對菌株GL2硝化特性的影響

分別設定搖床轉速為100、140、180及220 r/min。對應DO分別為3.8、5.2、7.0及8.5 mg/L。將菌株以1%接種量接入培養液中，置于30 ℃搖床培養，取樣及指標測定同1.6.1節。

1.6.5有機氮源對菌株GL2硝化特性的影響

在異養硝化培養基中分別添加1%的玉米漿、牛肉膏、蛋白胨以及酵母膏，以原異養硝化培養基作為對照，取樣及指標測定同1.6.1節。

1.6.6菌株GL2好氧反硝化特性考察

將菌株GL2轉接至異養硝化培養基中，置于30 ℃搖床培養，搖床轉速為180 r/min，培養24 h后取樣，定量測定NH4+-N、NO2--N、NO3--N及羥胺濃度。

1.7分析方法[9-10]

本研究分析方法詳見表 1。

表1　分析方法

2結果與討論

2.1異養硝化菌株的篩選

通過對活性污泥連續數月的富集以及平板初篩，獲得初篩菌株102株，將初篩菌株分別接入異養硝化液體培養基進行培養，經定量測定氨氮去除率，獲得1株硝化效果最好的異養硝化菌株，編號GL2。選取該菌株進行后續硝化特性研究。

2.2菌株GL2形態學和理化特性

將菌株GL2在瓊脂平板上培養48 h，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，部分菌落呈半透明，部分菌落呈不透明。菌株GL2的形態學特征如圖1所示。觀察細胞大小為(0.3～0.5)μm×(1.0～2.5)μm，其理化特性見表2。

圖1　菌株GL2形態學特征

理化指標結果理化指標結果葡萄糖氧化+色氨酸脫氨酶-接觸酶+精氨酸雙水解酶-氧化酶+鳥氨酸脫羧酶-V-P+明膠液化+甲基紅+Tween80-4℃生長+硫化氫+42℃生長+酪素水解+淀粉水解-吲哚-

注：表中“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.3菌株GL2系統發育分析

菌株GL2系統發育樹如圖2所示。將獲得的GL2 16S rDNA序列在數據庫EzTaxon server 2.1中進行比對，比對結果發現，菌株GL12的16S rDNA基因序列與Bacillus(屬)中多數菌種的16S rDNA基因序列相似度>99%。其中與菌株Bacillus pumilus ATCC 7061(T)的16S rDNA基因序列的相似度達到99.9%，結合GL12形態學特征和理化特征，初步認定GL2屬于Bacillus sp.，將其命名為Bacillus sp.GL2。

圖2　菌株GL2系統發育樹

2.4異養硝化菌株GL2硝化特性研究

2.4.1碳源對菌株GL2硝化特性的影響

在異養硝化過程中，碳源為微生物的生長提供能量及合成產物的碳架，對微生物硝化過程具有重要的影響[11]。結合國內外研究者針對異養硝化菌硝化所需碳源的選擇，研究選取乙酸鈉、丁二酸鈉及檸檬酸鈉等3種碳源進行菌株GL2異養硝化特性研究。碳源對菌株GL2硝化特性的影響如圖3所示。由圖3可知，3種碳源對GL2的生長及脫氮特性影響較大，檸檬酸鈉和丁二酸鈉能顯著促進GL2的生長及氨氮的去除，且丁二酸鈉效果好于檸檬酸鈉，氨氮去除率分別達92.2%和88.1%。培養基的pH值也隨著碳源的利用產生OH-而呈現不斷升高的趨勢。而在乙酸鈉的培養基中則沒有效果，甚至氨氮濃度反而有所上升，這與吳建江等[12]的研究結果類似，分析原因可能是前兩類碳源作為速效碳源，大大有利于微生物相關代謝循環的進行，而底物乙酸鈉不能夠及時誘導菌株GL2產生相關代謝酶系，導致菌株不能進行正常的新陳代謝，出現老化裂解死亡，從而釋放胞內氮，使培養基氨氮濃度升高。綜上所述，在后續研究中應以丁二酸鈉作為異養硝化培養基中唯一碳源。

圖3　碳源對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.2C/N對菌株GL2硝化特性的影響

相關研究表明，在菌株異養硝化過程中，培養基的碳氮比越高，菌株獲得的能量越充足，菌株的生長及異養硝化活性越好[13]，研究異養硝化菌株GL2硝化反應所需的最適碳氮比對其在實際廢水硝化脫氮應用中具有重要意義。碳氮比對菌株GL2生長及異養硝化特性的影響如圖4所示。由圖4可知，培養基中C/N比越高越有利于菌株GL2的生長，菌株異養硝化活性越高，同時培養基內pH值升高趨勢也越顯著。在C/N為2時，由于菌體生長所需碳源嚴重不足，導致菌體生長緩慢，同時培養基中pH值后期出現下降的現象，這可能是由于菌體自溶后，釋放出胞內的酸性物質所致。隨著培養基C/N的不斷升高，菌株GL2的生長特性及異養硝化特性得以恢復并加強，尤其在C/N為15時，培養基中氨氮殘留量僅為2.1 mg/L，氨氮去除率高達99.5%，無論在氨氮負荷耐受能力方面，還是在氨氮去除率方面，菌株GL2均優于目前分離出的絕大多數異養硝化菌[14-15]。垃圾滲濾液等高濃度有機廢水的C/N一般均>15，因此，菌株GL2對于此類廢水的脫氮處理具有很大的潛在應用價值。

圖4　C/N對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.3初始pH值對菌株GL2硝化特性的影響

環境中的pH能夠影響微生物營養物質的可給性，同時也會影響到微生物細胞內代謝酶系的活性，對菌株生長和異養硝化過程有著較大的影響，菌株對pH值的適應性將會成為其能否進行高效脫氮反應的關鍵[16]。pH值對GL2異養硝化特性的影響如圖5所示。當pH值為5時，GL2幾乎不能進行生長及進行硝化反應，說明低pH值條件抑制了菌體誘導酶的合成，同時大大降低了菌體合成酶的活性，導致GL2既不能正常生長又不能進行硝化代謝。當pH值為6～10時，GL2能很好地生長并進行硝化反應，平均氨氮去除率>99.0%，最大的氨氮去除率高達99.7 %。而目前分離出的異養硝化菌大都只能在中性偏堿性的條件下才能進行較好的硝化反應，如李衛芬等[17]的研究表明，菌株F1在pH>8時就表現出菌株長勢減弱、反硝化硝化效率降低的現象。吳建江等篩選出的異養硝化菌XS76雖然也能適應較寬的pH域，但是其氨氮去除率較低，最高為99.0%。GL2上述特性表明其具有較廣的pH適應力，在pH值為6～10時，均可以進行快速生長脫氮，其pH耐受范圍優于目前分離出的絕大多數異養硝化菌株。

圖5　初始pH值對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.4DO對菌株GL2硝化特性的影響

DO的大小直接影響菌株生長及代謝活性，在微生物生長環境中，DO過低或過高均會減緩或抑制菌體的生長[18-20]。本研究通過改變搖床轉速來調節培養基中的DO。對菌株GL2硝化特性的影響如圖6所示。由圖6可知，在其他因素相同的條件下，當搖床轉速越高，菌株生長及氨氮去除活性越高。當DO為3.8 mg/L時，GL2的生長及氨氮去除出現一定程度延遲，但當DO分別為5.2、7.0及8.5 mg/L時，菌株GL2的菌體密度、培養基pH值以及氨氮去除率相差無幾，氨氮去除率均能達到99.0%以上，說明菌株GL2在一定范圍內不受DO大小的影響，具有較好的DO耐受性；因此，在實際工程廢水處理中，只要能夠將DO值控制在5.2～8.5 mg/L，GL2就能夠進行快速生長及高效硝化反應，縮短廢水脫氮工藝的調試周期，節省調試投入成本。

圖6　DO對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.5有機氮源對菌株GL2硝化特性的影響

在垃圾滲濾液一類高濃度有機廢水中，有機氮會在氨化細菌的作用下發生氨化反應，導致廢水中氨氮濃度的升高。何霞等[21]研究發現，在菌株Bacillus sp. LY培養過程中，由于氨化反應產生的氨氮的量大于菌株LY利用量，導致氨氮濃度增加了98.0 mg/L。由圖7可知，在GL2培養初期，蛋白胨和牛肉膏有機氮源組，尤其是蛋白胨有機氮源組氨化作用要顯著強于硝化作用，因而對應培養基中的氨氮濃度迅速上升，而此后則主要通過異養硝化作用而使氨氮濃度不斷下降，表明菌株的有機氮去除能力相對較強。且相比于無機氮源，GL2在有機氮源中生長更快，硝化活性更高。這表明GL2氮源底物利用范圍較廣，有利于高濃度廢水脫氮處理應用。

圖7 有機氮源對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.6菌株GL2好氧反硝化特性考察

目前，分離出的少數異養硝化菌具有好氧反硝化特性[22]。為考察菌株GL2是否具有好氧反硝化特性，本研究對菌株GL2進行了培養基氮素平衡的考察。由表3可知，GL2經過24 h的培養，被GL2同化吸收的氨氮約為57.7 %，同時通過GL2反硝化作用去除的氨氮約為40.7 %，反應末期硝酸鹽氮積累僅約為2.8 mg/L。上述結果表明，異養硝化菌株GL2具有好氧反硝化特性，可實現單一反應器內同步硝化反硝化脫氮反應。

表3　菌株GL2的反硝化功能

3結語

綜上所述，可以得出如下結論。

1)通過傳統微生物學技術從活性污泥中篩選到1株高效異養硝化菌GL2，經過菌種鑒定，初步認定菌株GL2為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為Bacillus sp.GL2。

2)碳源、C/N、溶解氧(DO)、初始pH值及有機氮源均對菌株硝化特性有較大影響，在丁二酸鈉為碳源、硫酸銨為氮源、碳氮比為15、溶解氧為3.8～8.5 mg/L和pH值為6～10的條件下，氨氮去除率最高達99.7%，顯示出該菌株耐氧耐酸堿的高效硝化能力。

3)菌株GL2經過24 h的培養，培養基中約40.7%的氮通過反硝化作用以氣體的形式釋放，具有同步硝化反硝化特性，可實現單一反應器內同步硝化反硝化脫氮反應，可作為實際廢水硝化處理的備用菌源。

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責任編輯馬彤

Research on Screening and Nitrification Characteristics of a Efficiently Heterotrophic Nitrifier Resistanting Oxygen, Acid and Alkali

HAO Yongli1, WANG Qingsheng2

(1.Solid Waste and Chemicals Management Center, MEP, Beijing 100029， China；2.Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012， China)

Abstract：A heterotrophic nitrifier is isolated from the activated sludge of landfill leachate through specific select medium. It is identified as Bacillus sp. named as GL2. Its nitrification function is studied to show that the factors including carbon source, C/N, pH, DO and organic nitrogen are important for nitrification of strain GL2. The optimized condition for nitrification is as follows: sodium succinate as the carbon resource, C/N of 15, pH of 6-10, DO of 3.8-8.5 mg/Land the initial ammonia nitrogen of 420 mg/L. Combining these conditions, the removal rate of ammonia nitrogen reaches 99.7%. The strain has the capability to achieve aerobic denitrification. These results show that strain GL2 with highly effective heterotrophic nitrification could achieve simultaneous nitrification and denitrification.Hence, the strain GL2 could have high potential in practical wastewater treatment.

Key words:heterotrophic nitrification， screening， 16S rDNA sequence, nitrification characteristics， removal rate

收稿日期：2015-12-01

作者簡介：郝永利(1976-)，男，工程師，碩士，主要從事固體廢物及水污染防治技術研究及管理等方面的研究。

中圖分類號：X 172

文獻標志碼:A