氨溴索對大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響Δ

陳桂林，翁春梅， 劉廣軍，杜貫濤(常州市第二人民醫院藥學部，江蘇 常州　213003)

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氨溴索對大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響Δ

陳桂林*，翁春梅#， 劉廣軍，杜貫濤(常州市第二人民醫院藥學部，江蘇 常州213003)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.03.032

摘要目的：建立測定大鼠肺組織中氟康唑的高效液相色譜-紫外吸收檢測(HPLC-UV)法，探討氨溴索對大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響。方法：將實驗大鼠按隨機數字表法分為A、B組，每組各10只，A組大鼠首日經尾靜脈給予72 mg/kg注射用氟康唑，以后給予1日36 mg/kg；B組大鼠先經胃灌注給予6 mg/kg氨溴索，1日2次，上午給予氨溴索30 min后給予注射用氟康唑。連續給藥2 d后，第3日給予氟康唑后2 h對大鼠頸靜脈取血后解剖，取肺組織備用。采用HPLC-UV法同時測定最后一次使用氟康唑后2 h大鼠的肺組織濃度。結果：氟康唑線性范圍均為2.5～80 μg/ml之間，回歸方程為X=0.052C-0.027 6，相關系數r=0.999 9。A組大鼠肺組織氟康唑的濃度(28.1±19.6)μg/ml，B組為(26.6±17.7)μg/ml，2組的差異無統計學意義(P<0.05)。結論：氨溴索對肺組織中的氟康唑藥物濃度無顯著影響，但尚需結合臨床實際行進一步的研究。

關鍵詞氟康唑； 氨溴索； 藥物濃度； 高效液相色譜一紫外吸收檢測法

Effects of Ambroxol on Concentration of Fluconazole in Rat Lung TissueΔ

CHEN Guilin, WENG Chunmei, LIU Guangjun, DU Guantao (Dept.of Pharmacy, Changzhou the Second People’s Hospital, Jiangsu Changzhou 213003, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a HPLC-UC method of fluconazole and explore effects of ambroxol on concentration of fluconazole in rat lung tissue. METHODS: Rats were divided into group A and group B via the random number table, with 10 cases in each. And group A were treated with 72 mg/kg fluconazole injection by caudal vein in the first day, followed by 36 mg/kg for a day during the latter treatment. Group B received 6 mg/kg ambroxol by abomasum infusion, twice a day, and after the administration of ambroxol for 30 min in the morning, fluconazole injection was given. After administration of 2 d, 2 h after administration of fluconazole in the 3rdday, the blood was drawn from jugular vein of rats and then anatomy was conducted, lung tissue of rats were taken. HPLC-UV method was adopted to determine the concentration of rat lung tissue 2 hours after injecting fluconazole in the last administration. RESULTS: The calibration curve was linear with the logarithm of concentration range of 2.5～80 μg/ml of fluconazole ,he linear equation wasX=0.052C-0.027 6, the correlation coefficientr=0.999 9.The concentration of fluconazole in the lung tissue of group A was(28.1±19.6)μg/ml, and in group B was(26.6±17.7)μg/ml, the difference was not statistically significant(P<0.05). CONCLUSIONS: Ambroxol has no significant effect on concentration of fluconazole in the lung tissue, yet it still needs the further research combined with the clinical practice.

KEYWORDSFluconazole; Ambroxol; Drug concentration; HPLC-UC method

近年來，由于大劑量廣譜抗菌藥物的長期應用及造血干細胞移植、實體器官移植的廣泛開展，侵襲性肺部真菌感染的發病率明顯上升。目前，已知侵襲性肺部真菌感染最常見的致病菌為念珠菌，初始治療時首選氟康唑[1]。然而，氟康唑的廣泛使用導致了白念珠菌耐藥性的逐年增加[2-3]。有報道稱，氨溴索能明顯增加氨芐西林、阿莫西林、紅霉素等多種抗菌藥物在肺組織中的藥物濃度[4]，臨床常見氟康唑與氨溴索聯合使用，但至今無氨溴索對氟康唑在肺組織中藥物濃度影響的報道。本研究以大鼠作為研究對象，通過測定大鼠肺組織中氟康唑的濃度，探討氨溴索對氟康唑肺轉運作用的影響，為臨床合理用藥提供科學依據，現報告如下。

1材料

1.1儀器與設備

高效液相色譜儀，包括waters2695泵，2487紫外檢測器，Empower 2工作站(美國waters公司)； N-EVAP氮吹儀(美國Organomation 公司)；Allegra.TM. 21R型臺式冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；Milli-Q純水機(美國Mllipore公司)；XH-C型旋渦混合器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)。

1.2藥品與試劑

氟康唑對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100314-200503)。非那西丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100095-200204)；氨溴索片(常州市第四制藥廠，規格：30 mg，批號：20110524)；注射用氟康唑(山東羅欣藥業股份有限公司，批號：1106231，規格：0.1 g) 乙腈為色譜純；冰醋酸、氨水為分析純，水為超純水。

1.3實驗動物

實驗動物為健康SD大鼠，提質量220～240 g，由南京醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(蘇)2002-0031。

1.4方法

1.4.1色譜條件:色譜柱 MERCK Purospher C18(4.6×150 mm，5 μm)，Phenomenex ODS 預柱(4 mm×3 mm)；流動相為0.02 5mol/L，磷酸二氫鉀緩沖液(三乙胺調節pH為6.1)∶乙腈=(V∶V=75∶25)，檢測波長260 nm，流速1 ml/min，柱溫35 ℃；進樣量20μl。

1.4.2藥物制備:精密稱取氟康唑10.0 mg置于25 ml容量瓶中，加甲醇，即得400μg/ml的標準儲備液。精密稱取內標物非那西丁10.0 mg 置10 ml容量瓶中，加甲醇搖勻，即得1 000μg/ml的儲備液，兩種儲備液同置4 ℃冰箱中保存。

1.4.3樣品處理：精密吸取2 ml肺組織勻漿于5 ml離心管內，加入8 μg/ml非那西丁標準溶液20 μl，渦旋混勻15 s，加入4 ml乙酸乙酯，渦旋震蕩2 min，4 000 r/min離

心10 min，取上清液3 ml于10 ml尖底試管內，40 ℃水浴中氮氣流吹干，殘渣用150 μl流動相溶解，取20μl進行高效液相測定。

1.5動物模型

取大鼠20只，雌雄各半，按隨機數字表法分為A、B組各10只。A組大鼠首日經尾靜脈給予72 mg/kg注射用氟康唑，以后每日給予36 mg/kg；B組大鼠先經胃灌注給予6 mg/kg氨溴索，1日2次，上午給予氨溴索30 min后給予注射用氟康唑(氟康唑給藥劑量及方法同A組)。連續給藥2 d后，第3日給予氟康唑后2 h，對A、B兩組大鼠頸靜脈取血后解剖，取肺組織備用。取肺組織的方法：術前在大鼠腹腔注射10%水合氯醛30 mg/kg，待大鼠麻醉后固定四肢，仰臥位固定于操作臺上。打開胸腔，心臟穿刺放血處死，然后結扎右側肺門，取大鼠右肺，用冰冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗3次，洗去凝血塊，用濾紙吸干后稱質量，按質量(W)/體積(V)=1/10的比例加入預冷的0.9%氯化鈉注射液，置于超聲粉碎器中15 min，制成10%肺組織勻漿，4層紗布過濾后，取組織勻漿液保存于-80 ℃冰箱中待測。

1.6統計學方法

2結果

2.1方法專屬性

在上述色譜條件(1.4.1)下，氟康唑、非那西丁分離后所得色譜圖見圖1。

A 空白肺組織；B 空白肺組織+氟康唑+非那西??；C 肺組織樣品(1-氟康唑；2-非那西丁)A Blank lung tissue; B Blank lung tissue+Fluconazole+phenacetin; C Lung tissue sample(1-Fluconazole；2-Phenacetin)圖1　大鼠肺組織高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatograms of rat lung tissue

2.2線性關系及靈敏度試驗

在離心管中精密加入20 μl不同濃度的氟康唑標準溶液和內標溶液(8μg/ml)20μl，再加入空白肺組織勻漿2 ml，使氟康唑的濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/ml的系列樣品，然后操作，進樣后記錄樣品峰與內標峰峰面積，算出比值X，以濃度C對比值X作加權直線回歸計算，得出氟康唑的回歸方程為X=0.052C-0.027 6，相關系數r=0.999 9；線性范圍均為2.5～80 μg/ml之間。氟康唑檢測限為0.2 μg/ml。

2.3回收率試驗

制備含氟康唑及內標的混合肺組織樣品，濃度分別為2.5、10.0、80.0 μg/ml，按操作，分別記錄氟康唑峰面積與內標峰面積比值X，代入回歸方程，計算方法回收率(以測得量與加入量的比值計算回收率)，樣品絕對回收率，以及日內變異和5 d內的日間變異結果見表1。

2.4穩定性試驗

制備5份濃度為10.0 μg/ml的氟康唑的肺組織樣品，冰箱冷藏5 d，按“1.4.3”項下處理樣品，測定肺組織中藥物濃度，考察其穩定性，結果氟康唑相對偏差<6%，未發生明顯降解。

Tab 1Recovery rate and result of precision experiment

濃度(μg/ml)方法回收率/%萃取回收率/%日內精密度RSD/%日間精密度RSD/%2.5108.4±6.176.8±5.96.07.710.0102.4±2.579.1±3.93.45.780.099.6±3.279.3±2.13.83.3

2.5檢測結果

對處理過的肺組織進行濃度測定后可見，A組大鼠氟康唑的肺組織濃度為(28.1±19.6) μg/ml，B組為(26.6±17.7) μg/ml，2組的差異無統計學意義(P<0.05)。

Tab 2Determination result of fluconazole in lung tissue

組別12345678910肺組織濃度A組20.928.521.018.632.129.431.027.329.727.626.6±17.7B組22.828.620.124.532.824.630.025.934.837.028.1±19.6

3討論

3.1大鼠肺組織中氟康唑的測定方法的建立

因氟康唑和非那西丁二者分離度良好且能夠與雜質峰分離，系統理論板數較高。研究結果表明，用乙酸乙酯作為提取溶劑，峰形較好，且雜質不干擾樣品峰，回收率可達70%以上[5]。因此，本研究將其選為內標。建立測定大鼠肺組織中氟康唑的HPLC-UV法，以探討氨溴索對大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響。

3.2氨溴索對氟康唑藥物濃度的影響

真菌感染的死亡率較高，早期診斷和治療對患者的預后具有重要意義。臨床上常用的治療藥物主要為氟康唑、氟胞嘧啶和兩性霉素B等[6-7]。氟康唑是雙三唑類真菌感染治療藥，可抑制麥角固醇的合成，增加真菌細胞膜的通透性，使真菌死亡達到治療效果[8-10]。相關研究結果認為，抗菌藥物在細菌感染部位組織中的濃度是決定藥物療效的主要因素，在選擇敏感性抗菌藥物的同時，提高其在肺內轉運，尤其是感染灶中藥物濃度是決定臨床療效的關鍵[11]。

氨溴索是臨床上安全、有效的鎮咳祛痰藥，具有黏液溶解作用，可有效緩解呼吸道疾病的臨床癥狀；此外，氨溴索還可促進支氣管纖毛上皮的再生和功能恢復；刺激肺泡Ⅱ型細胞合成和分泌肺泡表面活性物質，防止肺泡萎縮和肺不張[12]。氨溴索還可增加抗菌藥物在肺組織及其分泌物質中的濃度，提高抗菌療效[13]。楊常菀等[14]和張志新等[15]研究結果表明，氨溴索可以增加利福平在大鼠肺組織中的濃度，并且認為氨溴索對抗菌藥物肺轉運的影響是非特異性的。氨溴索增加抗菌藥物肺組織濃度的原因尚不明確，可能與氨溴索能夠增強肺組織及呼吸道中的多種細胞活性，增強其化學驅化反應有關[16-17]。目前，臨床治療肺部疾病及真菌感染時常聯合應用氨溴索和氟康唑，以達到治療效果。但氨溴索能否增加肺組織中氟康唑的藥物濃度仍不明確。本研究檢測了SD大鼠肺組織中氟康唑的藥物濃度，結果顯示，A組大鼠肺組織濃度為(28.1±19.6)μg/ml，B組為(26.6±17.7) μg/ml，2組的差異無統計學意義(P<0.05)，說明氨溴索對大鼠肺組織中氟康唑的濃度影響很小。

綜上所述，氨溴索可能不會增加氟康唑在大鼠體內的肺轉運，進而增加氟康唑在肺組織中的濃度，也可能不會增強其抗真菌效力，原因可能與氟康唑表觀分布容積接近于體內水的總量，血漿蛋白結合率很低(約為11%～12%)，能良好地透入全身體液，在肺組織中的濃度接近血藥濃度等因素所致。但尚需結合臨床實際進行進一步的研究。

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(收稿日期：2015-07-24)

中圖分類號R965.1

文獻標志碼A

文章編號1672-2124(2016)03-0366-03

#通信作者：主任藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail：chunmeiweng@sina.com

Δ基金項目：常州市科技計劃項目(NO.CS20109012)

*主管藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail: chenguilin@126.com