HPLC同時測定復合營養谷物中的多種維生素方法

吳蓉

（江蘇省產品質量監督檢驗研究院，江蘇南京210000）

HPLC同時測定復合營養谷物中的多種維生素方法

吳蓉

（江蘇省產品質量監督檢驗研究院，江蘇南京210000）

采用等度洗脫反相高效液相色譜法，SunFireTMC18反相色譜柱，柱溫30℃，10mmol/L己烷磺酸鈉-乙腈（體積比為90∶10，pH=3.0）為流動相，流速1mL/min，紫外檢測器檢測，外標法定量，建立同時測定復合營養谷物中維生素C、煙酸、煙酰胺、維生素B1、維生素B2和維生素B6（包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺）等多種B族維生素的高效液相色譜（HPLC）分析方法。結果表明，維生素C、煙酸、煙酰胺在0.000 2～0.050 0mg/mL，維生素B2、維生素B6在0.000 5～0.050 0mg/mL及維生素B1在0.000 8～0.050 0mg/mL范圍內，線性良好，相關系數均大于0.999 4，精密度（RSD）0.88%～3.26%，回收率93.5%～101.0%。該法具有樣品前處理及上機操作簡單、準確度好、靈敏度高、適用性廣等特點。

復合營養谷物；高效液相色譜法；紫外檢測器

維生素是參與人體代謝和生命活動不可或缺的一類有機化合物，按照其物理性質，可將其分為兩大類，脂溶性維生素和水溶性維生素[1]，而維生素C及B族維生素則是生活中最為常見的一種水溶性維生素，人們的生理生活均離不開它。因此，通過復合營養食品攝取已成為補充人體維生素的一個重要渠道。

目前，在現有的國標方法中，檢測食品中維生素C的方法主要是熒光分光光度法，檢測B族維生素的方法主要有微生物法[2]、紫外分光光度法[3]、熒光分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]。分光光度法普遍存在準確度低、靈敏度差且檢測方法單一等缺點，因此未能被廣泛應用于食品中；而微生物法則耗時太長、干擾太大且操作繁瑣，所以也較少使用。因此，高效液相色譜法因其準確度高、樣品前處理方法簡單及儀器分析速度快，被廣泛應用于食品中水溶性維生素的測定。

高效液相色譜儀配有紫外檢測器及熒光檢測器2種，在現有的國標方法中，高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）被廣泛應用于維生素B1、維生素B2及維生素B6的測定，但實測結果遠比真實值高，回收率差；且該方法一次只能測定單一組分，對于多種B族維生素的測定存在較大困擾。因此，建立一種高效、準確且同時測定多組分的方法已是刻不容緩。

本文采用高效液相色譜-紫外檢測器（HPLCDAD）等度洗脫同時測定復合營養谷物中的多種維生素，國內外鮮有報道，具有基線穩定、分離度強、準確度高、樣品前處理簡單等特點。該方法的建立能夠為食品中維生素C及B族維生素的測定提供準確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

復合營養谷物購于江蘇省南京市各大超市。濃鹽酸（分析純），國藥集團化學試劑；己烷磺酸鈉（色譜純），山東禹王實業有限公司化工分公司；乙腈（色譜純），德國默克股份兩合公司；甲醇（色譜純），德國默克股份兩合公司；水（超純水）；維生素C（純度≥99.3%）、維生素B1、維生素B6（包括咇哆醛、吡哆醇、吡多胺）、煙酸和煙酰胺（純度≥100%），Accustandard公司；維生素B2（純度≥98.9%），Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；2996型紫外檢測器，美國Waters公司；XS 205DU型電子分析天平，美國梅特勒-托利多儀器公司；VM-8型渦旋儀，Blue Martin 公司；SB-5200DT型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；J-E型離心機，美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標準溶液的制備

精密稱取維生素C、煙酸、煙酰胺、咇哆醛、吡哆醇、吡多胺、維生素B2和維生素B1標準品適量分別于10mL容量瓶中，配制成質量濃度均為1mg/mL的標準儲備液。按照試驗所需要求，吸取不同體積的標準儲備液，用0.01mol/L的鹽酸溶液逐級稀釋成所需的混合標準工作液，以上操作均需避光。

1.3.2 鹽酸-甲醇溶液的制備

鹽酸-甲醇溶液（0.01mol/L）：吸取0.9mL濃鹽酸，溶于1 000mL水中，制成濃度為0.01mol/L的鹽酸溶液，再將其與甲醇以2∶8的比例混合均勻，即為20% 0.01mol/L鹽酸-甲醇溶液。

1.3.3 己烷磺酸鈉溶液的制備

己烷磺酸鈉溶液（10mmol/L）：準確稱取1.88g己烷磺酸鈉，加800mL超純水溶解，用0.01mol/L鹽酸調pH為3.0，定容至1 000mL，混勻。經0.45μm微孔濾膜過濾。

1.4 色譜條件

色譜柱，Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫30℃；流速1 mL/min；進樣量10μL；紫外檢測器（DAD）；檢測維生素C、煙酸、煙酰胺及維生素B1254nm，維生素B2及維生素B6280nm；流動相，流動性A為10mmol/L己烷磺酸鈉，B為乙腈，A∶B=90∶10，等度洗脫。

1.5 樣品前處理

準確稱取粉碎樣品1～5g（精確至0.000 1g）于50mL離心管中，試驗需要避光操作，加入20%0.01mol/L鹽酸-甲醇溶液25mL，渦旋混勻，超聲30min，1萬r/min離心5min，上清液經0.45μm微孔濾膜過濾，濾液待上機分析。

2 結果與分析

2.1 色譜流動相的優化

據文獻報道，該試驗可以采用己烷磺酸鈉-乙腈、磷酸二氫鉀-乙腈[1]作為流動相。試驗證明，采用磷酸二氫鉀-乙腈作為流動相時，基線不穩，且各組分并不能完全有效分離；而采用己烷磺酸鈉-乙腈時，不僅能夠達到較好的分離度，且準確度高。因而，該試驗最終采用己烷磺酸鈉-乙腈作流動相。同時，以己烷磺酸鈉-甲醇作流動相，分別采用梯度洗脫及等度洗脫，經試驗證明，梯度洗脫不僅基線不穩且耗時較長。因此，該試驗以己烷磺酸鈉-乙腈作流動相進行等度洗脫，同時比較了多種等度洗脫條件，最終確定將己烷磺酸鈉與乙腈的比例調到90∶10，可以在35min內有效地將8種水溶性維生素完全分離，且樣品分離效果良好，見圖1～4。

圖1 標準色譜圖（254nm）

圖2 標準色譜圖（280nm）

圖3 樣品色譜圖（254nm）

圖4 樣品色譜圖（280nm）

2.2 樣品前處理條件的簡化

在現有的國標方法中，前處理步驟復雜，如維生素B1及維生素B2的測定均要先調pH再過夜酶解，致使樣品回收率較低、準確度不高且耗時長。因此，該試驗采用20% 0.01mol/L鹽酸-甲醇溶液作為提取液，直接提取且無需過夜酶解，能有效沉淀蛋白，將國標中復雜的前處理步驟簡化，且回收率高。

2.3 最低檢出限

吸取適量的維生素標準儲備液，稀釋，定容，配制成維生素標準混合液。其中，維生素C、煙酸、煙酰胺的濃度為50μg/mL，維生素B6、維生素B2、維生素B1的濃度為100μg/mL，用0.01mol/L鹽酸逐級稀釋成一系列不同濃度的混合標準工作液（n=6），按照1.3.2的色譜條件進行分析，以峰面積（Y）對濃度（X）繪制標準標準曲線進行線性擬合，以3倍信噪比（S/ N=3）計算儀器檢出限（LOD），測得各種維生素（維生素C、煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1）的檢出限（LOD）。

2.4 標準溶液曲線及線性范圍

分別準確吸取1.3.1中配制的維生素C、煙酸、煙酰胺、咇哆醛、吡哆醇、吡多胺、維生素B2和維生素B1標準混合工作液，按1.4色譜條件，注入到高效液相色譜儀中，得到峰面積（或峰高），以峰面積（或峰高）為縱坐標（Y），以混合標準工作液濃度為橫坐標（X），計算得到線性回歸方程，線性相關系數及線性范圍，見表1。

表1 8種維生素的標準工作曲線和線性范圍

2.5 精密度測定

準確吸取8種維生素的標準混合工作液10μg/mL，重復進樣6次，以峰面積計算精密度，相對標準偏差（RSD）在0.88%～3.26%，精密度很好，見表2。

2.6 回收率試驗

稱取復合營養谷物樣品6份，按2種加標量分別加標，按照1.5節樣品前處理方法處理樣品后，按照1.4節色譜條件上機測定，測得復合營養谷物中各種維生素的加標回收率及精密度（RSD）見表3。

表2 8種維生素的精密度結果

表3 樣品的回收率結果

3 結論

該文建立了高效液相色譜法同時測定復合營養谷物中的多種維生素。結果表明，該法具有樣品前處理簡單、準確度好、分離效果好、適用性廣等特點。該方法可以為復合營養谷物中多種維生素的測定提供更加準確的測定方法，從而為食品的安全及質量提供更有力的技術保障。

[1]任丹丹,謝云峰,劉佳佳,等.高效液相色譜法同時測定食品中9種水溶性維生素[J].食品安全質量檢測學報,2014,5(3):899-904.

[2]殷曉紅,楊金寶,劉波,等.微生物法測定食品中的煙酸和煙酰胺[J].中國乳品工業,2003,31(2):32-35.

[3]吳秀生,張爽,張麗媛,等.紫外可見分光光度法測定維生素B1含量[J].黑龍江醫學,2011,24(2):170-171.

[4]任一平,陳恒武,陳青俊,等.柱后光化學衍生熒光檢測高效液相色譜法測定食品中的維生素B1[J].分析化學,2000,28(5):554-558.

[5]李莎.HPLC測定谷維素雙維B片中維生素B1和維生素B6的含量[J].中國生化藥物雜志,2010,31(3):176-178.

Simultaneous Determination of Vitamins in Compound Nutrition Grains by HPLC

Wu Rong
(Jiangsu Institute of Product Quality Supervision and Inspection,Jiangsu Nanjing 210000)

Using isocratic reversed-phase HPLC,SunFireTMC18 column,the column temperature was 30℃,10mmol/L sodium 1-octanesulfonate - acetonitrile (the volume ratio of 90∶10,pH=3.0) as mobile phase,flow rate 1mL/min,UV detector and quantified by external standard method,HPLC analysis method of simultaneous determination of composite grains of vitamin C,niacin,nicotinamide,vitamin B1,vitamin B2and vitamin B6(pyridoxine,pyridoxal,pyridoxamine including high performance liquid) and other vitamin B was established.The results showed that the linear relationship was in the range of 0.000 2～0.050 0mg/mL for vitamin C,nicotinic acid and nicotinamide,0.000 5～0.050 0mg/mL for vitamin B2and vitamin B6,0.000 8～0.050 0mg/mL for vitamin B1,the correlation coefficients were greater than 0.999 4,the precision (RSD) was from 0.88% to 3.26%,the recovery rate was from 93.5% to 101.0%.The method has the advantages of simple sample pretreatment,simple operation,good accuracy,high sensitivity and wide applicability.

Compound nutrition grain;High performance liquid chromatography;Ultraviolet detector

TS201

A

2096-0387（2016）06-0024-04

吳蓉（1990-），女，安徽省宣城市人，碩士，助理工程師，研究方向：環境工程。