大白菜光周期調控因子CCA1的差異分析及功能標記開發

張志剛 劉栓桃 李巧云 王曉 王立華 趙智中 王淑芬 徐文玲 劉賢嫻 劉辰

摘要：本研究利用春季和秋季條件下光周期的變化趨勢，對兩個大白菜自交系06-247與He102的光周期敏感性進行了鑒定，結果是06-247對長日照敏感，而He102對長日照不敏感。采用同源克隆技術，比較分析兩材料光周期響應關鍵調控因子CCA1的全長cDNA序列，發現二者編碼區存在兩處6 bp插入/缺失和14處非同義SNPs差異；二者編碼產物分別包含552、556個氨基酸殘基；其非同義SNPs造成不同氨基酸的替換；二者間氨基酸序列差異主要位于CCA1蛋白中間區域的蛋白-蛋白相互作用結構域和C端的磷酸化修飾結構域。本研究開發出區分兩處6 bp插入/缺失的共顯性分子標記。該結果為深入研究CCA1在大白菜光周期響應調節過程中的功能奠定了基礎。

關鍵詞：大白菜； 依賴/不依賴長日照開花型；BraCCA1；插入/缺失突變；功能標記

中圖分類號：S634.103.6文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0001-06

對春白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis） 而言，耐抽薹是一個至關重要的指標。抽薹之后必然伴隨開花，因此抽薹屬于大白菜開花途徑的一個發育過程。大白菜與模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）同屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica），因此有關擬南芥開花途徑的分子機制研究結果對大白菜相關研究有較大借鑒價值。對擬南芥開花途徑的分子機制研究表明，植物的開花受四條途徑控制，即春化途徑、光周期途徑、自主途徑和赤霉素途徑[1]。大白菜屬于兩年生長日照植物，在長期進化過程中，適應了當年秋季結球、次年春季抽薹開花的特性，因此它由營養生長向生殖生長的轉變除了需要明顯的環境低溫外，還需要相對較長的日照，即春化和長日照是誘導大白菜開花的主要環境因子[2]。在春白菜生產實踐中，春季溫度波幅較大，且常有倒春寒的影響，春化難以避免，而日照長度的變化則隨著時間的推移呈現恒定的變化趨勢，是變化穩定的環境因子。所以選出的長日照依賴型晚抽薹比耐低溫晚抽薹的大白菜材料在生產上表現更穩定，有望創制出更耐抽薹的大白菜種質。

抽薹開花的光周期調控途徑涉及復雜的晝夜節律鐘調控網絡，晝夜節律鐘核心震蕩子包括 CCA1 和 LHY 兩個MYB類轉錄因子，二者同源性較高，以同源或者異源二聚體結合于目的基因啟動子區的相應元件發揮作用[3]。CCA1和LHY單基因功能缺失突變體都有短日照下早抽薹開花的表型，可以縮短光周期2～3 h[4]。擬南芥中的CCA1包含663個氨基酸殘基，N端第11～82位氨基酸殘基是MYB結構域，負責與啟動子元件結合[5]；第136～316位氨基酸殘基與蛋白二聚化有關，負責蛋白-蛋白相互作用；C端是磷酸化調節區，其中的絲氨酸殘基是潛在的磷酸化修飾位點[6]。凡是能夠影響上述關鍵功能域結構的氨基酸突變都有可能影響CCA1的功能，從而影響其介導的光周期開花響應。研究者分別從楊樹、大麥、玉米[7～9]等植物中克隆出相應的CCA1，分子進化關系表明，它們在單雙子葉植物間非常保守，其N端的核酸結合結構域的氨基酸序列相似度高達79%以上，而鮮見同一物種中基因多樣性的報道。本研究從不同光周期依賴型大白菜材料中分別克隆了CCA1全長cDNA，發現二者編碼區存在兩處插入/缺失突變，利用生物信息學技術對其氨基酸序列進行分析，開發出區分這兩處插入/缺失突變的共顯性標記，旨在為利用CCA1基因突變培育耐抽薹春白菜提供理論依據和可供選擇的標記。

1材料與方法

1.1試驗材料

耐抽薹大白菜自交系06-247是市售日本春白菜F1的自交分離系，易抽薹大白菜自交系He102是我國地方品種“河南二包頭”的自交分離系。

1.2試驗方法

1.2.1光周期敏感試驗試驗于2010年至2013年在山東省農業科學院蔬菜花卉研究所核心試驗基地進行，常規管理。試驗一（長日照）：2010年8月10日正常播種，田間常規管理，11月21日采收健康母株，11月30日定植于日光溫室；試驗二（長日照）：2012年12月28日催芽育苗，2013年3月7日定植于紗棚；試驗三（短日照）：2013年6月采收的飽滿種子，浸種催芽后將萌動的種子置于4℃冰箱春化處理35天，8月20日播種于含營養土（基肥∶壤土∶蛭石=1∶1∶1）的花盆內。每材料播種5～10株。所有試驗常規肥水管理，隨時觀察長勢，記錄現蕾期、始花期，薹高（短縮莖長）的調查與測量參照余洋俊[10]和張德雙[11]等的方法，取平均值，以厘米（cm）為單位，并用DPS軟件進行顯著性檢驗。

1.2.2CCA1的全長cDNA克隆及序列分析大白菜幼苗長至二葉一心期時，取真葉組織約1 g立即置液氮中研磨、Trizol （Invitrogen Cat. No. 15596-026）法提取總RNA并反轉錄合成cDNA第一鏈 （天根試劑盒KR104并按說明書操作）。用Primer Premier 5.0軟件根據BRAD數據庫中CCA1的參考序列設計基因特異性引物（pF1：5′-TCGAGTGGTTCTAGTTTCTCAATCG-3′，pR1：5′-AAGACTATGGACAAAATACACAGGC-3′），以cDNA為模板用高保真Taq酶進行PCR擴增。PCR反應體系：5×HF Buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 μmol/L，下同） pF1 1 μL，引物 pR1 1 μL，全式金高保真酶 （北京全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase，AP221-01） 1 μL，模板1 μL，ddH2O 32 μL。PCR 反應程序：95℃預變性 2 min；95℃變性 20 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 90 s，循環 35 次；72℃后延伸 5 min。用 1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確認有特異性目的條帶后取1 μL PCR產物和1 μL平端載體（北京全式金pEasy-Blunt，CB101-01）于室溫（25℃）進行15 min的連接反應。熱激法轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞（北京全式金，CD501-01），菌落PCR檢測陽性克隆，取陽性克隆送北京華大基因有限公司進行測序驗證。序列分析采用DNAMAN軟件進行。

1.2.3功能標記開發及應用針對兩材料中CCA1編碼區兩處InDels差異，在其兩端分別設計特異引物進行PCR擴增，引物序列為PF1： 5′-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3′，PR1：5′-CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3′；PF2：5′-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3′，PR2：5′-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3′。擴增產物用6.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染照相。用開發的標記檢測部分大白菜材料，驗證標記的實用性。

2結果與分析

2.1光周期敏感性鑒定

光周期敏感性調查結果見表1。由試驗一和試驗二可知，He102與06-247在春分節氣前（短日照條件下）都可以正?，F蕾，表明春分前的低溫足以使二者通過春化，但06-247現蕾時間明顯晚于He102。二者始花期出現的時間亦顯著不同，試驗一中He102始花期介于2月中旬，此時花薹長達23 cm左右，表明He102在短日照條件下可以正常抽薹開花，也說明該材料抽薹開花不依賴長日照；06-247則不然，其始花期在春分以后的3月下旬，且此時花薹極短，二者始花期薹高差異極顯著。另外，從試驗一的田間觀察發現，06-247始花期時花粉極少，人工輔助授粉難以結莢，說明日照相對較短時花粉生活力較差，要等到4月中下旬，日照時數接近14 h時其花粉才能發育正常。由此可見，06-247抽薹開花依賴于長日照。試驗三的結果進一步表明，短日照條件下（9月下旬秋分后），He102在通過春化后可以正常抽薹開花，而06-247雖然可以分化花芽，但始終沒有抽薹，花蕾也不能開放，甚至出現結球現象。綜上所述，He102的現蕾、抽薹和開花均不依賴長日照，06-247的現蕾對長日照依賴性不強、而抽薹和開花則必須在長日照下才能進行。由此推斷，大白菜的花芽分化（現蕾）與抽薹開花可能受不同的基因控制，屬于不同的農藝性狀。利用自然日照長短的變化，將試驗一/二與試驗三結合，可以有效鑒定大白菜抽薹開花對長日照的依賴性。

2.2CCA1全長cDNA克隆及氨基酸序列分析

CCA1是模式植物擬南芥中調控光周期的關鍵轉錄因子，因此本研究采用同源克隆技術克隆了兩材料中CCA1全長cDNA，PCR擴增結果如圖1所示。經測序驗證，發現長日照依賴型耐抽薹材料06-247的CCA1編碼區長1 659 bp，與BRAD數據庫中Chifu-401的序列完全同源，而來自長日照不依賴型極易抽薹材料He102的CCA1編碼區長1 671 bp。后者除了比前者多兩處6 bp的插入外，整個編碼區還有23處SNPs（圖2A），其中14處是非同義突變，造成不同氨基酸的替換突變（圖2B）。經預測，前者編碼產物包含552個氨基酸殘基，后者包含556個，二者分子量分別是60.14 kD和60.58 kD。

圖206-247與He102的CCA1編碼區序列（A）及氨基酸序列（B）比較依據全長cDNA推導的氨基酸序列差異見表2。在兩材料CCA1全長cDNA之間的兩處6 bp插入/缺失中，第一處是t.329_330 ins CGGAAG，使He102的CCA1 蛋白第112位后的氨基酸插入Gly和Ser兩個殘基；第二處是t.1407_1408 ins CAACAA，導致He102的CCA1在469位氨基酸之后插入兩個Gln （圖2B）。其余非同義突變造成不同氨基酸的替換，其中性質差異較大的有118 Pro>Thr、119 Gly>Cys、125 Glu>Gln、176 Asn>Lys、440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、465 Lys>Gln、467 Glu>Lys。另外，440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、528 Ser>Asn、529 Asn>Ser與絲氨酸的替換有關，是潛在的磷酸化修飾位點。

根據擬南芥CCA1的結構域分布特點，He102中的突變位點主要位于第113位氨基酸之后，主要在蛋白-蛋白相互作用區和磷酸化修飾區。上述性質差異較大的氨基酸替換突變，位于蛋白-蛋白相互作用結構域的有可能影響CCA1的空間折疊結構，而位于C端與絲氨酸有關的四處突變可能影響磷酸化修飾位點。

2.3基于小片段插入缺失的共顯性標記開發

06-247與He102的CCA1編碼區兩處小片段插入/缺失大小僅為6 bp，一處靠近5′端，另一處靠近3′端。在突變區域兩側保守區設計引物，使擴增片段介于100～200 bp間，用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳對擴增片段進行檢測，結果見圖3A，表明6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠很好地區分6 bp的差異。用其中位于3′端的標記檢測了部分大白菜資源（圖3B），從圖中可以看出，所開發的標記擴增條帶清晰、沒有雜帶干擾，適合用于種質資源的基因型篩查。

3討論與結論

耐抽薹大白菜種質的創新是春白菜育種的關鍵，而耐抽薹性狀的正確評價及有效篩選直接關系到耐抽薹種質的創新效率。大白菜耐抽薹性狀的評價方法較多，大都采用不同的低溫春化處理，根據處理一定時間后材料的現蕾和開花早晚來判斷其耐抽薹性，且一般將現蕾期、始花期和始花期薹長共同作為判定耐抽薹的標準[10，11]。這在一定程度上增加了耐抽薹性狀QTL定位研究的復雜性，難以得到精細的定位結果。如張磊[12]利用類似的耐抽薹鑒定方法定位了9個與耐抽薹有關的QTLs，于拴倉[13]則定位了6個。有的研究者雖然注意到光周期對一些大白菜抽薹開花有影響，也發現現蕾和抽薹不一致[14，15]，但并未提出長日照依賴型抽薹開花的概念，仍將現蕾、抽薹、開花綜合作為耐抽薹性狀。本研究首次發現06-247與He102現蕾和抽薹是兩個獨立的性狀，為下一步耐抽薹性狀精細解析和精準定位奠定了基礎。本研究試驗二和試驗三相結合，可以有效判定大白菜材料的抽薹開花是否依賴長日照，為長日照依賴型表型鑒定提供了新的方法。

自然界日照長短是恒定變化的環境因子，植物為了響應光周期的變化，進化出復雜的調控機制。本研究基于模式植物擬南芥光周期誘導開花的調控機制，從光周期關鍵調控因子CCA1著手，發現06-247與He102的CCA1在蛋白-蛋白結合區和磷酸化修飾區存在氨基酸插入/缺失和替換突變。這可能導致兩者CCA1蛋白功能的差異，從而導致兩材料對光周期敏感程度不同，即CCA1是潛在的光周期調控關鍵功能基因?；诰幋a區小片段插入/缺失的差異，本研究開發出區分兩個大白菜品種的共顯性分子標記，該標記位于功能基因內部，是潛在的功能標記，為下一步耐抽薹種質篩選、耐抽薹大白菜新品種輔助育種及耐抽薹性狀精細定位研究提供了可供選擇的標記。

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