黃瓜NRT2基因的鑒定和特征分析

孫建磊 董玉梅 王崇 肖守 李利斌 焦自高

摘要：本研究利用生物信息學方法，從黃瓜基因組中鑒定出3個NRT2基因，并對這些基因的基因組分布、結構、遺傳進化和順式元件進行了系統分析。結果顯示，黃瓜的NRT2基因分別位于1號、1號和5號染色體，具有2個或3個外顯子，分別與擬南芥的NRT2.4或者NRT2.5直系同源；它們都具有數個植物激素和逆境應答元件，暗示它們不僅在氮素吸收過程中具有一定功能，而且與植物逆境應答有關。該結果為進一步研究黃瓜NRT2的功能提供了線索。

關鍵詞：黃瓜；硝態氮轉運蛋白NRT2； 分子特征；系統進化；順式元件

中圖分類號：S642.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0011-04

氮素是植物必需的大量元素之一，對作物生長起著非常重要的作用，它是植物體蛋白質、核酸、葉綠素的組成部分。施用氮肥不僅能提高農產品產量，還能提高農產品質量[1]。硝態氮是植物利用土壤中氮素的主要形態。植物對硝態氮的吸收主要通過硝態氮轉運蛋白進行[2，3]。植物硝態氮轉運蛋白主要分為低親和性和高親和性兩種[4，5]。在模式植物擬南芥中，NO-3的轉運是通過硝態氮轉運蛋白NRT1、NRT2和NRT3調控的[6～8]。NRT1家族為低親和性轉運蛋白，NRT2為高親和性轉運蛋白，而NRT3不具有轉運功能，主要是通過調控NRT2基因來發揮作用[9]。它們在氮素吸收轉運、根系發育、生物和非生物逆境應答過程中具有重要功能[10～16]。

黃瓜是我國主要設施栽培蔬菜之一，在蔬菜生產中具有重要地位。研究黃瓜氮素吸收機理，有助于合理施肥，提高黃瓜氮肥利用效率，減少環境污染。目前，有關黃瓜氮素吸收的研究已有報道，姚娟等報道了亞適溫對4個黃瓜NRT基因和1個AMT基因表達的影響[17]；趙春波等研究了北方地區不同黃瓜品種氮素吸收與利用效率的差異[18]；Migocka等研究了黃瓜NRT1家族的組織表達特異性及與擬南芥、水稻等NRT1基因在結構和數量上的差異[19]；Nikolic等研究認為黃瓜葉片中硝態氮的轉運與細胞膜上ATPase的活性和數量有關[20]；Li等研究了黃瓜硝酸還原酶在缺氮條件下的分子特征[21]；秦智偉等克隆了黃瓜的NRT1.5基因，并對其表達進行了分析[22]。但是有關黃瓜NRT2的研究較少，本研究利用生物信息學方法鑒定出3個黃瓜NRT2基因，并對其分子結構特征、遺傳進化和順式調控元件進行了系統分析，為將來研究黃瓜NRT2基因的功能提供線索。

1材料與方法

用已鑒定的擬南芥NRT2基因序列搜索黃瓜基因組數據庫（http：//cucumber.genomics.Org.cn/page /cucumber/blast.jsp）和NCBI數據庫，尋找黃瓜新的NRT2基因。利用BLASTP在擬南芥數據庫TAIR中進行序列比對，確定黃瓜NRT2基因與擬南芥NRT2基因的關系。利用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch /cgi-bin/motif_scan） 對黃瓜NRT2基因編碼的蛋白進行保守基序和結構預測分析，并根據編碼區序列信息對其進行染色體定位。利用Mega 4.1對黃瓜NRT2基因進行系統進化分析。通過NRT2編碼區和基因組序列比對來顯示基因外顯子和內含子的結構組成，得到各個NRT2基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動子區及上游序列。順式元件預測采用PlantCARE軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcareplantcare/html/）進行在線分析。亞細胞定位預測在WoLFPSORT （http：//wolfpsort.org/） 中進行。

2結果與分析

2.1黃瓜NRT2的鑒定和分子特征

通過對黃瓜基因組數據庫和NCBI數據庫黃瓜基因的挖掘和分析，筆者鑒定出3個黃瓜NRT2基因Csa017175、Csa017221和 Csa000871（表1）。這3個基因分別位于黃瓜的1號、1號和5號染色體上?；蚪Y構分析表明，它們含有2個或者3個外顯子，亞細胞定位預測結果顯示它們均定位于細胞膜上（圖1）。

2.2黃瓜NRT2基因的遺傳進化和編碼蛋白的基序分析

通過對黃瓜NRT2基因遺傳進化分析和不同物種間同源序列比對顯示，Csa000871與擬南芥的NRT2.5直系同源，Csa017221和Csa017175與擬南芥的NRT2.4直系同源（圖2）。而且，Csa017221和Csa017175緊密連鎖，編碼區大小和結構一致，二者序列一致性極高，達99.62%，編碼蛋白的序列一致性高達99.25%。它們的蛋白基序除了一個酰胺化位點的差異外，其余基序的類型和數目相同（表2）。Csa000871編碼的蛋白與上述兩個蛋白在基序類型上相似，但在基序數量上有所不同，根據結構決定功能的生物學特性，推測黃瓜的3個NRT2基因在功能上存在一定差異。

2.3黃瓜NRT2的順式元件及功能預測

通過對順式調控元件的分析得出，黃瓜NRT2基因的上游序列中存在多個逆境和激素應答順式調控元件，且各不相同（表3）。在Csa017175上游序列中分別存在1個ABA 應答元件ABRE、乙烯應答元件ERE、赤霉素應答元件TATC-box、水楊酸應答元件TCA-element；Csa017221分別存在1個病原物應答元件Box-W1、茉莉酸甲酯應答元件CGTCA-motif、赤霉素應答元件GARE-motif、防衛應答元件W-box，還分別有2個熱脅迫應答元件HSE、2個水楊酸應答元件TCA-element以及3個逆境和防衛響應元件TC-rich repeats；Csa000871分別有1個赤霉素應答元件TATC-box、1個逆境和防衛響應元件TC-rich repeats、2個病原物應答元件Box-W1、2個防衛應答元件W-box、4個水楊酸應答元件TCA-element。雖然，Csa017175和 Csa017221在核酸和編碼蛋白的序列一致性上高達99%，但它們的順式調控元件差異較大，暗示它們在功能上存在分化。根據順式調控元件分析和進化分析的結果，推測Csa000871在氮素吸收以及再分配及生物逆境脅迫應答中具有一定功能，而Csa017175和Csa017221對缺氮條件下植物根和地上部氮素的吸收具有雙重功能。此外，Csa017175還參與ABA、乙烯和水楊酸及赤霉素信號應答，而Csa017221在病原物脅迫和防衛應答、熱脅迫、赤霉素、水楊酸及茉莉酸甲酯信號應答中具有一定功能。其實際功能需要進一步試驗驗證。

3結論

本研究通過對鑒定出的3個黃瓜NRT2基因的系統分析，發現它們分別位于1號、1號和5號染色體上，具有2個或者3個外顯子，分別與擬南芥的NRT2.4或者NRT2.5直系同源。黃瓜3個NRT2編碼的蛋白除了Csa017221含有一個酰胺化位點外，其它基序類型都相同，但在數目上有差異。Csa017221 和Csa017175在結構上相似，序列上幾乎一致，但它們上游順式調控元件差異較大，說明它們的表達調控有所不同。黃瓜的NRT2基因都具有數個植物激素和逆境應答元件，暗示它們不僅在氮素吸收過程中具有一定功能，而且與植物逆境應答有關。本研究為進一步探明黃瓜NRT2的功能提供了線索。

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