陜西省地方酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

梁寧利，巨亞杰，馮艷蕓，鞏蓬勃

（寶雞出入境檢驗檢疫局，陜西寶雞　721006）

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陜西省地方酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

梁寧利，巨亞杰，馮艷蕓，鞏蓬勃

（寶雞出入境檢驗檢疫局，陜西寶雞721006）

摘要：從5種陜西省市售地方酸奶中分離出乳酸菌，研究乳酸菌分離株對多西環素、萬古霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、四環素、鏈霉素以及紅霉素這7種抗生素的耐藥性。利用MRS培養基和MC培養基，通過劃線分離培養分離酸奶樣品中的乳酸菌，對分離株進行甲苯胺藍染色初級鑒定，同時采用紙片擴散法進行耐藥性對比。從5種品牌酸奶中共分離出5株菌株，包括桿菌4株、球菌1株，用紙片擴散法進行耐藥性測定均沒有檢測到獲得性耐藥表型。

關鍵詞：保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；分離；耐藥性

0　引言

酸奶是以鮮奶為原料，經過巴氏殺菌后添加發酵劑發酵后，再冷卻灌裝的一種發酵乳制品。乳酸菌作為主要發酵劑，因其良好的發酵性能和益生功效在發酵食品行業中占有不可替代的位置。乳酸菌是指發酵糖類，主要代謝產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[1]。乳酸菌有較長的安全使用歷史，長期以來發酵產品中所使用的乳酸菌普遍被人們認為是安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株，并且它還與人以及動物腸道內生微生物群落存在著相互作用，產生益生作用，有益于人和動物的健康[2]。2002年，國際乳業聯合會公布的在發酵乳制品中有長期安全使用歷史的微生物名單中細菌有18個屬81個種，其中乳桿菌有36個種、雙歧桿菌有8個種[3]。德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌是目前制作酸奶的主要發酵劑，所有酸奶的標簽上都標注有這2種乳酸菌。

近幾十年來，抗生素在醫療、獸醫以及動物飼料等行業得到了廣泛應用，甚至出現了濫用現象，導致微生物耐藥問題日趨嚴重，使人們在應對細菌感染疾病時將面臨前所未有的挑戰[4]。早期有關細菌耐藥的研究主要集中在病原微生物的研究上，但是近些年對于環境中的共生細菌以及以乳酸菌為代表的益生菌耐藥的關注越來越多[5-6]。在研究初期，學者們認為，乳酸菌的耐藥對其定植于人類或動物腸道內發揮益生功效有一定的幫助，但隨后越來越多的報道顯示乳酸菌的耐藥機制與許多病原菌的耐藥機制十分相似。已有報道稱某些乳酸菌攜帶耐藥基因且具有相應的耐藥表型[7]，如Mathur，Hummel以及Cataloluk等人就在發酵食品中檢測到紅霉素和四環素的耐藥基因[2，5，8]；在生產酸奶用的乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的某些菌株中也檢測到一些耐藥基因[5]。這些乳酸菌作為益生菌在進入人體后（尤其是腸道），有將耐藥基因水平傳播給體內的其他細菌，包括條件致病菌和致病菌的可能性[9]，從而對人類健康產生潛在的威脅。因此，是否具有耐藥性或攜帶耐藥基因已經成為評價益生菌安全與否的重要標準之一[10]。

近年來，國內外越來越多的研究表明，長期以來被認為安全的、廣泛應用于發酵食品領域的乳酸菌已經產生耐藥并攜帶了相應的耐藥基因。因此，通過研究陜西地區市售酸奶樣品中乳酸菌，對7種具有代表性奶牛常用抗生素的耐藥性進行對比，為評價酸奶中乳酸菌菌株的安全性及篩選安全菌株提供一定的參考依據。

1試驗材料與試劑

1.1試驗材料

5種陜西地方市售酸奶，購自寶雞人人樂超市，分別為A，B，C，D，E品牌。

1.2試驗試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸二胺、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫- 80、瓊脂、碳酸鈣、醋酸、大豆蛋白胨、乳糖、中性紅、蒸餾水、氯化鈉、甲苯胺藍，以及K2HPO4，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O均為市售分析純。

1.3試驗儀器

恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司產品；高壓滅菌鍋，日本ALP公司產品；PHS- 3C型pH計，上海儀電分析儀器有限公司產品；雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；UX6200H型分析天平，北京賽多利斯儀器系列有限公司產品。

2試驗方法

2.1培養基的配制

（1）MRS瓊脂培養基的配制。①材料：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二胺2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫- 80 1 mL，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，MgSO4· 7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g。②制法：將以上成分加入到蒸餾水中，加熱使完全溶解，調pH值6.2～6.4，分裝于三角瓶中，于121℃下高壓滅菌21 min。將MRS培養基用醋酸調節pH值至5.4，制成酸化MRS培養基，將MRS培養基除去瓊脂，制得液態MRS培養基。

（2）改良MC培養基的配制。①材料：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸鈣10.0 g，瓊脂15.0 g，中性紅0.05 g。②制法：將以上成分加入到蒸餾水中，加熱使完全溶解，調節pH值至6.0左右，于121℃條件下滅菌20 min。

2.2酸奶梯度稀釋

吸取1 mL酸奶于9 mL的生理鹽水中混勻，此為1×10-1稀釋液；再取1×10-1稀釋液1 mL于9 mL生理鹽水中，此為1×10-2稀釋液。以此類推，做到1×10-6梯度（此操作均在無菌條件下進行）。

2.3 5種品牌酸奶中乳酸菌的活菌數計數

取上述6個連續稀釋度的稀釋液0.1 mL分別置于2個MRS瓊脂平板上，使用L形棒進行表面涂布，倒置41℃兼性厭氧培養48 h（從樣品稀釋到平板涂布整個試驗過程要求在20 min內完成）。選取菌落數為30～300的平板進行計數，計數方法是每1 mL樣品中的乳酸菌數=該皿內的乳酸菌數×稀釋倍數。方法參考國標GB/T 4789.35—2010。

2.4 5種品牌酸奶中乳酸菌的分離純化

乳酸菌在MRS培養基上菌落特征見表1。

表1　乳酸菌在MRS培養基上菌落特征

根據乳酸菌在MRS培養基上菌落特征，挑選3個或3個以上可疑單菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC培養基，保加利亞乳桿菌接種于加碳酸鈣（按3％ M/V的量加入滅菌碳酸鈣）并酸化的MRS培養基，倒置41℃兼性厭氧培養48 h。

2.5乳酸菌的純培養

酸奶中保加利亞乳桿菌在酸化的MRS培養基上菌落直徑為1～3 mm，無色素，呈白色至淡灰色，菌落表面較粗糙，菌落周圍產生碳酸鈣的溶解圈[11]。酸奶中嗜熱鏈球菌在MC培養基上可見紅色菌落，表面光滑、邊緣整齊，菌落大小為2 mm左右[12]。每種菌種挑選3個可疑菌落接種于斜面培養基上，每個菌落接種3個斜面培養基，置于41℃下兼性厭氧培養48 h。

2.6乳酸菌純種的形態鑒定

從斜面培養基上選取單菌落進行甲苯胺藍染色。保加利亞乳桿菌菌體形態多樣，呈長桿狀，彎曲桿狀或短桿狀，無芽孢。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑0.5～2.0 mm，成對或呈鏈排列，無芽孢。

2.7乳酸菌濃度的確定

2.7.1接種

用接種環無菌操作取保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌1～2環分別放入200 mL的MRS液體培養基中，于41℃下恒溫培養。

2.7.2培養

分別于0，4，6，8，10，12，16，20 h取出10 mL培養液放冰箱中儲存，待測定。

2.7.3活菌計數

將待測試樣進行梯度稀釋至10-5，取0.2 mL按GB/T 4789.35—2010進行乳酸菌活菌數檢驗，以活菌數為1.50×108CFU/mL的時間為最佳培養時間。

2.8含菌培養基的制備

用無菌棉簽沾取菌液，在試管內壁擠壓出多余液體后，涂布MRS平板，連續涂布3次，每次旋轉60°，最后繞平板邊緣涂抹1周，將平皿蓋微開3～5 min，待培養基表面多余水分被吸收后，蓋上平皿蓋，配置好的菌懸液應在15 min內使用。

2.9乳酸菌的耐藥性測定

每個培養皿取一個位置為基準點，并用記號筆在背面做上標記，抗菌藥物紙片以順時針方向貼加，其順序為多西環素、萬古霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、四環素、鏈霉素以及紅霉素。用鑷子貼抗菌藥物紙片，每次鑷子夾紙片前灼燒滅菌，紙片貼上后輕壓確保其貼牢，紙片貼后位置不應再移動。兩紙片中心距離＞24 mm，紙片距平板內緣＞15 mm。置于41℃下兼性厭氧培養48 h。

2.10乳酸菌耐藥性結果判定標準

用刻度尺量取抑菌環直徑，根據美國臨床實驗室標準化協會CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）報告[13]判斷細菌對該抗生素是敏感（susceptible S）、耐藥（resistant R）還是中介（intermediate I）。

細菌耐藥性解讀標準見表2。

表2　細菌耐藥性解讀標準

3結果與分析

3.1 5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量見表3。

表3　5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

由表3可以看出，A品牌酸奶中乳酸菌活菌數最多，其次是D品牌，乳酸菌數最少的是品牌E。國家質量技術監督局發布的酸奶國家標準（GB/T 4789.35—2010）中規定[14]，產品中的乳酸菌數不得低于1×106CFU/mL。其中，低于國家標準規定的有1份樣品，這可能是由于該菌種的耐氧性能較差，而在試驗過程中無法提供嚴格厭氧環境；但也不排除在添加菌種的過程中，沒有做好品質控制，混勻不均，致使不同批次產品中含有的益生菌數量不同；同時，也不排除菌株自身品質的問題。

3.2乳酸菌的初步鑒定

從5種品牌分離純化菌株的初步鑒定試驗結果。

菌株1.1122見圖1，菌株1.2122見圖2，菌株1.3121見圖3，菌株1.5121見圖4，菌株1.3232見圖5。

圖1　菌株1.1122

圖2　菌株1.2122

圖3　菌株1.3121

圖4　菌株1.5121

圖5　菌株1.3232

對酸奶樣品進行分離后，共得到5株純菌株，其菌落特征與乳酸菌符合。甲苯胺藍染色鏡檢初步判斷其中菌株1.1122、菌株1.2122、菌株1.3121及菌株1.5121為桿菌，菌株1.3232為球菌，總之共獲得桿菌4株、球菌1株。獲得純的球菌明顯少于桿菌，原因可能是球菌對桿菌的依賴性更強，離開桿菌球菌很難生長；也可能是在分離過程中使用的培養基對球菌的選擇性更差。

3.3細菌濃度的確定

乳酸菌達到0.5麥氏（1.50×108CFU/mL）濃度時所需要的培養時間見表4。

表4　乳酸菌達到0.5麥氏濃度時所需要的培養時間

由表4可以看出，對乳酸菌進行液體培養后，乳酸菌的對數生長期在6～14 h，找到A，B，C這3種品牌的乳酸菌培養時間為8 h時，細菌濃度達1.50× 108CFU/mL；D與E這2種品牌的乳酸菌培養時間為10 h，細菌濃度達1.50×108CFU/mL。

3.4乳酸菌的耐藥性測定結果

菌株1.1122的耐藥性見圖6，菌株1.2122的耐藥性見圖7，菌株1.3121的耐藥性見圖8，菌株1.5121的耐藥性見圖9，菌株1.3232的耐藥性見圖10，乳酸菌的耐藥情況見表5。

圖6　菌株1.1122的耐藥性

圖7　菌株1.2122的耐藥性

圖8　菌株1.3121的耐藥性

圖9　菌株1.5121的耐藥性

圖10　菌株1.3232的耐藥性

表5　乳酸菌的耐藥情況

由表5可以看出，5株菌株均對鏈霉素耐藥，沒有菌株對頭孢吡肟、四環素、紅霉素以及多西環素耐藥；以上結果與秦宇軒和李晶等人[15]的報道一致。3株菌株對慶大霉素和萬古霉素耐藥。所檢測的5株乳酸菌均對四環素類、β-內酰胺類和大環內酯類抗生素表現為敏感，這與Charteris，Coppola和Zhou等人[16-18]的研究結果一致。乳酸菌對氨基糖苷類抗生素和萬古霉素的耐受性屬于天然耐藥，檢測的5株乳酸菌均對鏈霉素表現為耐藥，有3株對慶大霉素表現為耐藥，有3株對萬古霉素耐藥，以上結果與Mathur，Hummel和Danielsen等人[19-21]的報道一致。

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Shaanxi Province where the Separation of Lactic Acid Bacteria in Yogurt Identification and Drug Resistance Analysis

LIANG Ningli，JU Yajie，FENG Yanyun，GONG Pengbo
（Baoji Entry- exit Inspection and Quarantine Bureau，Baoji，Shaanxi 721006，China）

Abstract：This paper from 5 kinds of lactic acid bacteria is isolated in shaanxi provinces and cities selling place of yogurt，the separation of lactic acid bacteria strains to doxycycline，vancomycin，cefepime，gentamycin，tetracycline，streptomycin and erythromycin the 7 kinds of antibiotic resistance. Using MRS culture medium and cultivated by streak MC medium separation of lactic acid bacteria in yogurt samples，toluidine blue staining the primary identification of the isolates，resistance comparison by disc diffusion method at the same time. Isolated from five brand yogurt of the communist party of China from 5 strains，4 strains bacillus，staphylococcus aureus 1 strain，by disc diffusion method for determination of resistance acquired drug resistance phenotypes are not detected.

Key words：Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilic；separate；drug resistance

作者簡介：梁寧利（1981—），女，本科，工程師，研究方向為食品檢測。

收稿日期：2016- 01- 14

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0040- 04

中圖分類號：R155.5

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.011