血清B細胞刺激因子及C3d結合型供者特異性抗體在腎移植術后慢性抗體介導排斥反應中的診斷價值

范博涵 楊曉勇 錢小松 張希諾 劉航 王瑋 胡小鵬 張小東

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·論著·

血清B細胞刺激因子及C3d結合型供者特異性抗體在腎移植術后慢性抗體介導排斥反應中的診斷價值

范博涵 楊曉勇 錢小松 張希諾 劉航 王瑋 胡小鵬 張小東

目的 觀察血清B細胞刺激因子(BAFF)與C3d結合型供者特異性抗體(DSA)在腎移植術后慢性抗體介導排斥反應(AMR)中的診斷價值。方法 回顧性分析2010年5月至2012年5月于首都醫科大學附屬北京朝陽醫院行同種異體腎移植術的109例受者資料，觀察術后3年慢性AMR發生情況。病理診斷為慢性AMR的患者，留取診斷時刻靜脈血5 mL；同時留取與慢性AMR患者同期行腎移植術、未發生慢性AMR的受者血樣。檢測血清BAFF值、群體反應性抗體(PRA)和DSA，PRA強陽性和DSA陽性者檢測血清C3d結合型DSA。繪制BAFF和C3d結合型DSA受試者工作特征(ROC)曲線，計算靈敏度、特異度、約登指數及曲線下面積。P<0.05為差異有統計學意義。結果 109例腎移植受者中，共19例病理診斷為慢性AMR，血樣平均留取時間為術后(28±7)個月，同期手術且未出現慢性AMR的32例受者血樣留取時間為術后(27±5)個月。慢性AMR患者和同期手術的非慢性AMR患者DSA陽性比例、C3d結合型DSA陽性比例和BAFF值分別為52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2 070±825)pg/mL和(790±293)pg/mL，差異均有統計學意義(χ2=43.59、6.18，t=23.745，P均<0.05)，PRA陽性比例兩組差異無統計學意義。血清BAFF和C3d結合型DSA診斷慢性AMR的靈敏度、特異度、約登指數和ROC曲線下面積分別為83%和77%、79%和83%、0.62和0.60、0.78和0.79，ROC曲線下面積差異無統計學意義(P>0.05)。結論 血清BAFF和C3d結合型DSA對診斷腎移植術后慢性AMR有一定價值，可作為高?；颊咴\斷慢性AMR的輔助手段。

腎移植； B細胞刺激因子； C3d； 供者特異性抗體； 抗體介導排斥反應

腎移植已經成為終末期腎病患者的重要治療方式[1]，這得益于對排斥反應更好的控制、手術技術的提高、臨床管理以及對術后感染、腫瘤、心血管疾病等并發癥治療方法的改善。慢性抗體介導排斥反應(antibody mediated rejection，AMR)仍然是移植物遠期存活的最大障礙[2]。預測慢性AMR的生物標記對其早期診斷和治療顯得尤為重要。

有證據表明，B細胞在移植排斥反應的發生發展過程中可能發揮重要的作用。B細胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)是一種對B細胞生成、成熟以及活化具有重要作用的同型三聚體。急性實體移植器官衰竭患者的免疫組織化學標本中可以看到與C4d相伴隨出現的BAFF沉積[3]；在發生慢性排斥反應的移植腎中，也可以看到BAFF信使RNA以及蛋白表達升高[4]。Banham等[5]研究發現，在ABO血型不相容腎移植受者中，血清BAFF升高與AMR明顯相關，BAFF可能可以預測AMR的發生風險；同時，中和AMR患者體內BAFF可能成為值得探索的治療方法。

C3d是補體C3經過經典途徑、旁路途經或甘露糖結合凝集素途經活化裂解而來的最小片段，是補體活化的標志，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要蛋白質分子。目前，已有一些研究將免疫組織化學C3d染色應用于移植腎、心臟等體液排斥反應的檢測[6-7]。本研究旨在觀察血清BAFF和C3d在慢性AMR中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2010年5月至2012年5月因終末期腎病于首都醫科大學附屬北京朝陽醫院泌尿外科行同種異體腎移植的109例受者資料。男性72例，女性37例；平均年齡(42±11)歲(22～69歲)。原發病包括：慢性腎小球腎炎77例，糖尿病腎病9例，高血壓腎病2例，多囊腎11例，IgA腎病9例，外傷1例。103例受者為首次移植，6例為再次移植。全部供、受者ABO血型相符，術前群體反應性抗體(panel reactive antibody，PRA)陰性，淋巴細胞毒交叉配合試驗均為陰性。

109例受者術中均給予甲潑尼龍1 000 mg，術后500 mg/d連用3 d；術后采用環抱素/他克莫司+嗎替麥考酚酯+醋酸潑尼松三聯免疫抑制方案。他克莫司起始劑量為0.1 mg·kg-1·d-1，環孢素起始劑量為6.0 mg·kg-1·d-1，根據血藥濃度調整用量；嗎替麥考酚酯2 000 mg/d；醋酸潑尼松5～10 mg/d。出現病理診斷的急性排斥反應則予以抗胸腺細胞球蛋白治療。

1.2 研究方法

所有受者均隨訪3年，觀察慢性AMR發生情況。病理診斷為慢性AMR的患者，留取診斷時刻靜脈血5 mL；同時留取與慢性AMR患者同期行腎移植術、未發生慢性AMR的受者血樣，檢測血清BAFF值、PRA和供者特異性抗體(donor specific antibody，DSA)，PRA強陽性及DSA陽性的患者同時檢測血清C3d結合型DSA。術后3年內未出現慢性AMR的受者留取術后3年血樣，檢測血清BAFF值。

(1)血清BAFF值檢測：采用ELISA法進行檢測(美國R&D Systems公司試劑盒)，具體步驟參照試劑盒說明書進行，正常參考值為850 pg/mL[8]。

(2)PRA檢測：采用LABScreen法(美國One Lambda公司)進行檢測[9]。結果以平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)表示，MFI>1 000為陽性，>8 000為強陽性。

(3)DSA檢測：采用Luminex?技術檢測特異性抗體。HLA-Ⅰ類抗體包括HLA-A、B、Cw特異性抗體，HLA-Ⅱ類抗體包括HLA-DRB1、DQB1、DPB1特異性抗體。結果以MFI表示，MFI>1 000為陽性。

(4)C3d結合型DSA檢測：采用Luminex?技術檢測PRA強陽性(調整的MFI>8 000)及DSA陽性(調整的MFI>3 000)患者血清C3d結合型DSA。

1.3 統計學方法

2 結 果

109例受者移植術后3年血清肌酐中位數為121 μmol/L(65～341 μmol/L)，血紅蛋白中位數為10.7 g/dL(7.7～14.7 g/dL)，平均血清BAFF值為(1 040±85)pg/mL。共19例患者病理診斷為慢性AMR，血樣平均留取時間為術后(28±7)個月(14～36個月)，同期行腎移植但未出現慢性AMR的32例受者血樣平均留取時間為術后(27±5)個月(16～36個月)。19例慢性AMR患者中，男性13例，女性6例，平均年齡(44±10)歲(28～58歲)；32例同期手術的非慢性AMR受者中，男性21例，女性11例，平均年齡(41±8)歲(23～55歲)。

共檢出20例PRA強陽性，15例DSA陽性。慢性AMR患者和同期手術的非慢性AMR受者的DSA陽性比例、C3d結合型DSA陽性比例和BAFF值分別為52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2 070±825)pg/mL 和(790±293)pg/mL，兩組差異存在統計學意義(χ2=43.59、6.18，t=23.745，P均<0.05)；兩組PRA陽性比例分別為52.6%(10/19)和31.2%(10/32)，差異無統計學意義(P>0.05)。

以病理診斷的慢性AMR為金標準，繪制ROC曲線。血清BAFF和C3d結合型DSA預測腎移植術后慢性AMR的診斷效能指標見表1。血清BAFF和C3d結合型DSA ROC曲線見圖1，2。MedCalc軟件比較BAFF和C3d結合型DSA ROC曲線下面積，發現差異無統計學意義(P>0.05)，二者診斷慢性AMR準確性均較高。

表1 血清BAFF和C3d結合型DSA預測腎移植術后慢性AMR的診斷效能指標

注： BAFF. B細胞活化因子；DSA. 供者特異性抗體；AMR. 抗體介導排斥反應

3 討 論

BAFF是TNF家族成員，主要表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和活化的T細胞，有促進B細胞生成、存活以及成熟的作用[10-11]。在轉基因小鼠模型中發現，提高BAFF表達可以提高B細胞活性及數量，同時增加血液中丙種球蛋白、致病性自身抗體水平以及狼瘡樣自身免疫疾病的發生率[12]。BAFF對移植物的負面影響主要通過3種BAFF受體起作用：激活劑和鈣調親環素配體相互作用分子、BAFF-R及B細胞成熟抗原，這些受體主要表達于包括漿細胞在內的B細胞譜系。在小鼠心臟移植模型中，BAFF缺乏的受體小鼠，尤其是同時應用CNI的受體小鼠存活時間更長[13]。小鼠胰島移植模型中，BAFF被單克隆抗體阻滯后，可以觀察到MHC不相容胰島移植體存活[14]。在發生急性排斥反應的腎移植受者中，移植腎活檢免疫組織化學檢測可以看到BAFF伴隨C4d在移植腎中沉積[3]。亦有長期隨訪研究發現，外周血BAFF陽性CD4 T細胞與移植腎失功相關[15]。提高BAFF信使RNA和蛋白表達增加了慢性排斥反應的發生風險[16]。

當異物進入機體時，在體內沒有相應抗體的情況下，其自身及代謝產物，或非特異性免疫處理后的產物可以激活補體系統，補體激活的產物C3d與異物或抗原共價結合，通過CD21使B細胞參與免疫反應，起到連接固有免疫和適應性免疫的橋梁作用[17]。C3d的代謝速度慢，體內活化產生的C3d不會很快被清除，檢測C3d對了解補體活性具有重要意義。在人體內，除小部分C3d與免疫復合物或抗原結合外，大部分游離在體液中，并進入血液循環，雖然其在尿液中因個體差異及肌酐清除率不同而有很大差別，但在正常人血清中C3d水平穩定[18]。研究顯示，循環C3d結合型DSA的存在是診斷AMR時移植物丟失的獨立預測因子[19]。

對于移植術后慢性AMR的早期診斷，目前還沒有準確性較高的方法。PRA是各種組織器官移植術前篩選致敏受者的重要指標，與排斥反應、受者和移植物存活率密切相關[20]。而與PRA相比，DSA監測不僅能檢測供者HLA特異性抗體，還能檢測供者HLA交叉反應抗原的抗體，因此能更準確地反映受者體內致敏情況[21]。目前國內關于血清BAFF、C3d與移植術后AMR相關性的研究較少。移植術后移植物刺激機體產生各種免疫細胞，可能導致單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和活化的T細胞產生BAFF。這與Banham等[5]對腎移植術后血清BAFF的研究相似，該研究同樣顯示血清BAFF升高提示預后不良。國外諸多關于C3d的研究主要關注其在移植物中沉積的影響，結果顯示移植腎C3d沉積提示預后不良[14,17]，但對血清游離C3d研究較少。本研究評估了血清BAFF、C3d結合型DSA水平對同種異體腎移植術后慢性AMR的診斷價值，結果顯示血清BAFF及C3d結合型DSA診斷慢性AMR準確性均較高，二者無明顯差別。但是，本研究C3d的檢測是在DSA陽性或PRA強陽性的情況下進行，而血清BAFF的檢測并不需要以PRA及DSA檢測結果作為基礎，故更為簡便。

總之，血清BAFF、C3d結合型DSA檢測對診斷腎移植術后慢性AMR有一定意義，對腎移植術后可能發生慢性AMR的受者可以考慮聯合應用血清BAFF和C3d結合型DSA檢測協助診斷。然而本研究病例數較少，且缺乏移植腎病理兩種分子沉積的證據，故需要更多病例、更長隨訪時間的研究進一步證實結果。

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(本文編輯：鮑夏茜)

范博涵, 楊曉勇, 錢小松, 等. 血清B細胞刺激因子及C3d結合型供者特異性抗體在腎移植術后慢性抗體介導排斥反應中的診斷價值[J/CD]. 中華移植雜志: 電子版, 2016,10(4):165-168.

The value of serum B cell activating factor and C3d-binding donor specific antibody on diagnosis of chronic antibody mediated rejection after renal transplantation

FanBohan,YangXiaoyong,QianXiaosong,ZhangXinuo,LiuHang,WangWei,HuXiaopeng,ZhangXiaodong.

DepartmentofUrology,Chao-YangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,ChinaCorrespondingauthor:ZhangXiaodong,Email:zxd581@263.net

Objective To explore the value of serum B cell activating factor (BAFF) and C3d-binding donor specific antibody (DSA) on diagnosis of chronic antibody mediated rejection (CAMR) after renal transplantation. Methods The clinical data of 109 recipients who received renal transplantation in Beijing Chao-Yang Hospital during May 2010 to May 2012 was retrospectively analyzed. Incidence of CAMR in 3 years after renal transplantation was investigated. Once the recipients were diagnosed with CAMR, 5 mL of venous blood sample would be preserved, meanwhile, venous blood samples of recipients who recieved renal transplantation during the same period and without CAMR were also preserved. BAFF, panel reactive antibodies(PRA)and DSA were detected, furthermore, samples with strong positive PRA and DSA positive were detected with C3d-binding DSA. Then ROC curves with BAFF and C3d-binding DSA were analyzed. Results Ninteen cases among 109 recipients were diagnosed with CAMR. The venous blood samples of 19 recipients with CAMR and recipients who recieved renal transplantation during the same period and without CAMR were kept for (28±7) months and (27±5) months, respectively. Proportion of DSA and C3d-binding DSA positive and BAFF value of 19 recipients with CAMR and recipients who recieved renal transplantation during the same period and without chronic AMR were 52.6% vs 15.6%, 26.3% vs 3.1%, (2 070±825) pg/mL vs (790±293) pg/mL, respectively, which were all statically significant (χ2=43.59、6.18,t=23.745,Pall <0.05). The sensitivity, specificity, Youden index and area under the ROC curve of serum BAFF and C3d-binding DSA on diagnosis of CAMR were 83% vs 77%, 79% vs 83%, 0.62 vs 0.60 and 0.78 vs 0.79, respectively. There was no statistical difference on area under the ROC curve between the two groups (P>0.05). Conclusion Serum BAFF and C3d-binding DSA had certain value on diagnosis of CAMR, which could serve as a supplemental method for diagnosing CAMR in recipients at high risk.

Renal transplantation; B cell activating factor; C3d; Donor specific antibody; Antibody mediated rejection

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.04.004

北京市醫院管理局臨床醫學發展專項經費(ZYLX201408)

100020 北京，首都醫科大學附屬北京朝陽醫院泌尿外科

張小東，Email：zxd581@263.net

2016-04-25)