番茄不孕病毒（TAV）脫除對懷白菊葉綠素含量及氮代謝相關指標的影響

趙喜亭 朱玉婷 田瑩 王昭陽 周穎媛 范子建 蔣麗微 李明軍

摘要：【目的】探究番茄不孕病毒（TAV）脫除對懷白菊葉綠素含量和氮代謝水平的影響，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應用提供理論依據?！痉椒ā恳郧捌讷@得的TAV脫除懷白菊試管苗為試材，以未經脫除TAV的試管苗為對照（CK），對兩者進行繼代培養，并測定培養過程中葉片葉綠素含量及氮代謝的相關生理指標?！窘Y果】繼代培養過程中，CK與TAV脫除懷白菊試管苗葉片的葉綠素α和葉綠素b含量隨培養天數的增加而升高，兩者均以繼代第22 d時的增幅最大，分別為5.24%和41.69%。與CK相比，TAV脫除提高了相同培養天數時葉片的葉綠素a、葉綠素b含量，且差異達顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01）水平。懷白菊脫除TAV病毒后，其硝酸還原酶（NR）活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量在繼代培養過程中均顯著高于CK，三者最大增幅分別為27.99%（繼代22 d）、28.10%（繼代22 d）和5.89%（繼代38 d）?！窘Y論】TAV脫除能有效提高懷白菊的葉綠素含量及氮代謝水平，利于其生長發育。

關鍵詞： 懷白菊；番茄不孕病毒；脫毒；葉綠素含量；氮代謝

中圖分類號： S567.239 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1095-05

0 引言

【研究意義】懷白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai）為菊科（Asteraceae）菊屬（Chrysanthemum L.）植物，特指產于古懷慶府（今河南省溫縣一帶）的藥菊，因其具有較高的藥用價值而備受青睞。懷白菊主要靠扦插、分株等營養方式進行繁殖，長期的營養繁殖使病毒危害嚴重，引起植株不同程度地花葉、壞死、萎縮等，嚴重影響其產量和品質。經過本課題組前期對河南省焦作市一帶染病懷白菊進行鑒定后發現，其主要感染病毒為番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV），并探明了TAV的結構和全核苷酸序列（Zhao et al.，2015）。TAV是一種RNA病毒，以非持久性的方式由多種蚜蟲傳播或汁液接種傳播，在懷白菊上普遍發生。因此，開展懷白菊TAV病毒脫除及脫除后對其生理生化影響的研究，可為懷白菊脫毒苗的大田推廣應用提供理論依據?！厩叭搜芯窟M展】針對病毒危害問題，各種植物脫毒技術應運而生并取得了較好的效果（Wang and Valkonen，2009；欒愛萍，2012；Budiarto，2013）。因懷白菊作為道地藥材的特殊性，為保持藥材的綠色環保，莖尖結合熱處理可作為其脫除病毒的首選方法。本研究室前期已通過莖尖結合熱處理脫除了懷白菊的TAV病毒。大量研究表明，植物脫除病毒后，其生理生化特性均會有一定程度的提高，如安徽藥菊（薛建平等，2004）、香石竹（王麗花等，2012）脫毒后其葉綠素含量提高，光合速率在一定程度上也隨之提高。氮代謝是植物體內一個重要的生理過程，直接影響著植物的產量和品質（張智猛等，2006），甘薯、蘋果脫除病毒后，光合能力提高，氮代謝活躍，葉片游離脯氨酸、可溶性蛋白含量增加，硝酸還原酶（NR）活性明顯增強（陳選陽等，2001；吳玉霞，2008；周全盧等，2014）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組結合懷白菊生產實際從2011年開始致力于病毒調查、鑒定、脫除及病毒脫除后的活性氧代謝與生理生化變化、脫毒苗的大田適應性等方面的研究，明確了TAV是其感染的主要病毒（Zhao et al.，2015），TAV脫除降低了其活性氧代謝水平，增強了其抗氧化能力（趙喜亭等，2015）。但TAV脫除對懷白菊葉片光合作用和氮代謝水平的影響尚不清楚，需進一步探討?！緮M解決的關鍵問題】以前期獲得的TAV脫除懷白菊試管苗為試材，通過對其光合和氮代謝相關指標進行測定，研究繼代培養過程中TAV脫除后懷白菊葉片葉綠素a和葉綠素b含量、NR活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量的變化，旨在探索TAV脫除對懷白菊光合和氮代謝水平的影響，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料原始植株具有感染病毒的特征，采集于河南科霖達菊珍飲品股份有限公司的懷菊花種植基地，由河南省溫縣農業科學研究所王天亮高級農藝師進行基原鑒定為懷白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai），之后在綠色藥材生物技術河南省工程實驗室（河南師范大學生命科學學院）建立無菌試管苗，采用莖尖結合熱處理的方法獲得莖尖苗，經RT-PCR檢測得到脫除TAV的懷白菊試管苗（繼代22 d）。

1. 2 試驗方法

試驗在河南師范大學綠色藥材生物技術河南省工程實驗室進行。將前期獲得的脫除TAV的懷白菊試管苗（Virus-free）及其對照苗（未經脫除TAV的試管苗，CK）在超凈工作臺上切成帶有腋芽的莖段（長約1 cm），接種于1/2 MS+NAA 0.01 mg/L生根培養基中，放入溫度為25 ℃、光強3000 lx、光照12 h的培養室中進行繼代培養，待培養至第22 d，挑選長勢基本一致的組培苗，取頂端完全展開第二、三片葉片測定其葉綠素含量及氮代謝相關指標，每隔8 d測定1次，即第22、30、38、46和54 d進行測定，每個指標測定3個樣本，共測定5次。

1. 3 測定項目及方法

葉綠素a和葉綠素b含量采用丙酮乙醇混合液比色法測定（李合生，2000），以丙酮乙醇混合液（體積比為1∶1）為提取液，按葉片∶丙酮（g∶mL）=1∶150比例在黑暗下提取24 h，于645和663 nm下進行比色，按下列公式計算葉綠素含量：

式中，Ca、Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度，A663和A645分別為葉綠素溶液在663和645 nm處的吸光值。

葉綠素含量（mg/g）=葉綠素濃度×提取液總體積×稀釋倍數/樣品鮮重

NR活力采用離體磺胺比色法測定（李合生，2000）；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定（李合生，2000）；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭染色法測定（趙喜亭等，2011）。

1. 4 統計分析

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 13.0進行整理及統計分析。

2 結果與分析

2. 1 TAV脫除對懷白菊試管苗葉綠素含量的影響

如圖1所示，在繼代培養過程中，懷白菊試管苗葉片中葉綠素a和葉綠素b含量變化趨勢相同，均隨培養天數的增加而升高，且TAV脫除未改變葉片葉綠素含量的變化趨勢。與CK相比，相同培養時間點下TAV脫除試管苗葉片的葉綠素a和葉綠素b含量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）升高，兩者均以繼代培養第22 d時的增幅最大，分別為5.24%和41.69%，與CK差異極顯著。

2. 2 TAV脫除對懷白菊試管苗氮代謝相關指標的影響

2. 2. 1 NR活力 由圖2可看出，繼代培養過程中，CK與TAV脫除試管苗葉片NR活力均隨培養天數的增加呈先升高后降低的變化趨勢，培養至第46 d時達最大值。TAV脫除試管苗葉片NR活力除在第46 d時顯著高于CK外，其他對應培養時間點的NR活力均極顯著高于CK，其中在繼代22 d時的增幅最大，為27.99%。

2. 2. 2 游離脯氨酸含量 由圖3可看出，繼代培養過程中， CK與TAV脫除試管苗葉片的游離脯氨酸含量均隨培養天數的增加而升高。與CK相比，TAV脫除提高了相同培養天數時葉片的游離脯氨酸含量， 繼代培養22、46和54 d時游離脯氨酸含量顯著提高，最大增幅為28.10%（繼代22 d）。

2. 2. 3 可溶性蛋白含量 由圖4可看出，繼代培養過程中，CK與TAV脫除試管苗葉片的可溶性蛋白含量均隨培養天數的增加而升高。與CK相比，TAV脫除顯著提高了與相同培養天數時葉片的可溶性蛋白含量，最大增幅為5.89%（繼代38 d）。

3 討論

葉綠素是與光合作用相關的重要色素分子，參與光能的吸收、傳遞和轉化，在光合作用中扮演重要的角色，其含量的高低在一定程度上可反映植物的光合能力（張國民等，2000）。葉綠素a是光合作用的中心色素分子，葉綠素b是聚光色素。植物感染病毒后，其葉綠體數量及結構會遭到不同程度破壞，導致葉綠素含量降低，進而影響植物光合作用。植物脫除病毒能夠降低病毒對其葉綠體數量及結構的傷害，使葉綠素含量有不同程度的提高，如薛建平等（2004）研究發現，安徽藥菊脫除病毒后葉綠素含量及凈光合速率均有所提高；葛曉霞等（2006）研究表明，脫毒駿棗樹葉片葉綠素含量均高于對照，光合速率總體明顯高于普通駿棗樹，尤其在上午8：00～12：00時平均增高10.7%～

76.6%；王麗花等（2012）研究表明，香石竹經過脫毒處理后其葉綠素a和葉綠素b含量均顯著高于非脫毒苗。本研究結果表明，與未進行脫毒的試管苗相比，TAV脫除提高了懷白菊繼代培養過程中相同培養天數時葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，且差異達顯著水平，其中葉綠素b含量最大增幅達41.69%（繼代22 d）。表明TAV脫除能夠使懷白菊維持較高的葉綠素水平，在相同光照條件下，能夠吸收更多光能，有利于提高懷白菊光合能力。

氮代謝是植物體內一個重要的生理過程，包括無機氮的還原、同化及有機含氮化合物轉化、合成等過程（Miller and Cramer，2004）。與其相關的生理指標主要有NR活性、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量等，這些指標對植物生長均具有重要作用（陳永明等，2014；孫菲菲等，2014；唐秀梅等，2014）。NR可催化植物體內硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是植物氮同化過程中關鍵的限速酶，葉片中NR活性的高低控制著整個同化過程，其強弱在一定程度上反映了光合、呼吸及蛋白質合成和氮代謝活性（張智猛等，2006；林麗琳等，2015）。脯氨酸是植物蛋白質的組分之一，并以游離狀態廣泛存在于植物體中，是逆境下植物體內氮和能量的貯存庫，對植物體內的酶和膜結構有保護作用（陸彬彬，2004）。大多數可溶性蛋白是參加各種代謝的酶類，其含量是植物總體代謝的一個重要指標（宋新穎等，2014）。研究表明，植物脫除病毒能夠降低病毒對其自身生理活動的影響，從而提高植物吸收和利用氮的能力，減少硝酸鹽的積累，促進氨基酸的合成，進而利于植株的生長，如陳選陽等（2001）研究表明，甘薯脫除病毒后其氮代謝活躍，葉片游離脯氨酸含量增加，硝酸還原酶活性明顯增強；吳玉霞（2008）研究發現，在試管苗生長后期，華紅、粉紅佳人和煙富一號3個蘋果品種脫毒苗葉片中的脯氨酸含量、硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量均顯著高于普通苗，且差異達極顯著水平。本研究結果與上述前人研究結果相似。本研究發現，懷白菊脫除TAV病毒后，其NR活力、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量在繼代培養過程中均顯著高于非脫毒苗，三者增加最大幅度值分別為27.99%（繼代22 d）、28.10%（繼代22 d）和5.89%（繼代38 d）。脫除TAV的懷白菊硝酸還原酶活性提高，能夠減少硝酸鹽在葉片內的積累，降低可溶性氮化合物的積聚，從而促進部分氨基酸與蛋白質的合成。說明TAV脫除使懷白菊在繼代培養過程中維持著較高水平的氮代謝。

植物氮代謝與葉綠素含量及光合能力密切相關。光合作用是作物生長最基本的生理過程之一，其生成的同化力和代謝中間產物被氮代謝所利用。氮是葉綠素、蛋白質和酶的重要組成物質，通過對植物葉綠素、光合速率、暗反應的主要酶以及光呼吸等的影響直接或間接影響植物光合作用（尹麗等，2011）。本研究發現TAV的脫除顯著增加了相同培養天數時懷白菊葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，顯著提高了懷白菊的NR活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量，且葉綠素a、葉綠素b含量增幅最大值出現的時間（繼代22 d）和NR活力、游離脯氨酸含量最高增幅出現的時間（繼代22 d）相吻合，進一步說明了植物氮代謝與葉綠素含量及光合能力具有相關性，且TAV脫除有利于提高懷白菊的光合能力和氮代謝水平。

為進一步探討TAV脫除對懷白菊光合及氮代謝的影響，今后還應對TAV脫除對懷白菊葉綠素熒光參數、光合特性參數（如凈光合速率、氣孔導度等）等指標及NR基因表達等方面進行深入研究。

4 結論

本研究結果表明，TAV脫除能夠有效提高懷白菊葉片葉綠素含量及氮代謝水平，利于其生長發育，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應用打下了基礎。

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（責任編輯 王 暉）