廣西崇左市山黃皮種質資源調查及ISSR遺傳多樣性分析

覃振師 鄧立寶 王文林 陳海生 譚德錦 黃錫云 湯秀華

摘要：【目的】分析廣西崇左市山黃皮種質資源的遺傳多樣性，為山黃皮資源的分類、鑒定、保護和開發利用提供理論依據?！痉椒ā空{查和收集廣西崇左市龍州縣、寧明縣、憑祥市、江州區、天等縣、扶綏縣和大新縣7個縣（市、區）的山黃皮種質資源，并進行ISSR-PCR擴增、聚類分析和主成分分析?！窘Y果】15條多態性ISSR引物可從50份山黃皮種質資源中擴增出136條帶，多態性條帶比例為55.15%；各山黃皮種質間的相似系數在0.769～0.942，平均0.875。聚類分析結果顯示，ISSR分子標記能將供試材料完全區分，在遺傳相似系數0.864處，可將50份山黃皮種質資源聚為A、B兩大組，其中A組包括來自龍州縣、寧明縣、憑祥市、江州區和扶綏縣的40份種質，B組包括來自天等縣和大新縣的10份種質。主成分分析結果表明，前三主成分貢獻率依次為12.11%、8.73%和7.68%，累積貢獻率為28.52%；主成分分析可將50份山黃皮種質資源分為兩大類，與聚類分析結果基本一致?！窘Y論】廣西崇左市山黃皮種質資源較豐富，大部分山黃皮種質親緣關系較接近，且與地理起源有一定的相關性，NM9、TD1、DX2和JZ5等遺傳差異較大的種質可作為山黃皮優良品種和單株選育及良種繁育等研究的重要材料。

關鍵詞： 山黃皮；種質資源；ISSR；廣西崇左市

中圖分類號： S663.9 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1071-06

0 引言

【研究意義】山黃皮[Clausena indica （Dalz.） Oliv]俗稱雞皮果，為蕓香科柑桔亞科黃皮屬（Clausena）多年生常綠大灌木或小喬木，其果實和樹葉均具有特殊香味，果皮、核、根可入藥，是優良調味佳品，且具有生津止渴的功效，其用途廣泛，經濟價值高（黃峰等，2005；梁立娟等，2011）。山黃皮主要分布于南亞熱帶地區的中國、越南、菲律賓等國家，在我國主要分布于廣西西南部、云南南部、廣東新會等地（藍慶江等，2008；覃振師等，2012）。廣西崇左市是我國最重要的山黃皮產區之一，資源豐富，分布范圍廣，但其山黃皮研究基礎薄弱，缺乏系統調查資料和遺傳多樣性信息，山黃皮品種分類較混淆，主觀性大，仍存在同物異名和同名異物的現象，影響了山黃皮種質資源的開發、利用和保護。因此，調查廣西崇左市山黃皮種質資源并研究其遺傳多樣性，對制定山黃皮產業發展規劃、開展科學研究和指導生產具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，分子標記技術被廣泛應用于黃皮屬種質資源研究。劉小梅等（2007）對影響RAPD-PCR擴增的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物濃度及退火溫度等因素進行優化，建立了黃皮RAPD-PCR反應體系。蔣素梅等（2008）采用RAPD分子標記技術對廣東、廣西廣泛栽培的14個黃皮品種進行遺傳多樣性分析，將供試黃皮品種（系）劃分為3個類群，與形態分類有一定的相似性，基本反映了黃皮品種間的遺傳多樣性。李開拓等（2009a，2009b）對ISSR-PCR反應中的主要影響因子進行單因素和正交試驗，建立了適宜黃皮ISSR分析的擴增體系；并采用ISSR分子標記技術對40個黃皮品種的遺傳多樣性進行分析，將供試黃皮材料分為5組，與形態學具有一定的相關性，但比形態分類更嚴格，在風味、種子等方面分類重復少。Zhao等（2010）從100個RAPD引物中篩選出1個與無核基因相連鎖的引物，可用于有效鑒定雜交種群體中的無核黃皮?！颈狙芯壳腥朦c】前人對黃皮屬種質資源遺傳多樣性的研究主要集中在黃皮栽培品種和育種材料，目前有關山黃皮種質資源遺傳多樣性的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過查閱相關資料、走訪專家、實地調查和生物學鑒定，對廣西崇左市山黃皮種質資源進行調查研究，并以簡單重復序列分子標記（ISSR）對其進行遺傳多樣性分析，為山黃皮種質資源的分類鑒定、優良品種培育和資源保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為從崇左市龍州縣、寧明縣、憑祥市、江州區、天等縣、扶綏縣和大新縣7個縣（市、區）收集的50份山黃皮種質資源（表1）。聚乙烯吡咯烷酮（CTAB）、DNA Marker、dNTPs、Tris-HCl等試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq DNA聚合酶購自上海英駿生物技術有限公司。采用的引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的引物序列進行設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 采用改良的SDS法（陳國平等，2011）提取山黃皮葉片DNA，用紫外分光光度計和1.0%

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量，將各樣品的總DNA稀釋至30 ng/μL。

1. 2. 2 引物篩選 用3個遺傳差異較大的山黃皮DNA樣品對合成的ISSR引物進行篩選，選取多態性好、擴增產物條帶清晰的15條引物用于所有DNA樣品擴增。

1. 2. 3 PCR擴增 在Biometra Tprofessional PCR儀上進行ISSR-PCR擴增，反應體系20.0 μL：模板DNA 1.0 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，4.0 mmol/L dNTPs 0.5 μL，30 μmol/L引物1.0 μL，0.40 U DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，復性退火（溫度隨引物而定）1 min，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 3 數據處理

根據分子標記的遷移率及其有無，統計每個樣品的擴增電泳譜帶，構建“0、1”二元數據矩陣，采用NTsys 2.10計算遺傳相似性系數。在遺傳相似系數矩陣的基礎上進行主成分分析和聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2. 1 ISSR標記檢測結果

篩選到15條多態性ISSR引物，并對50份山黃皮種質資源進行擴增，共擴增出136條帶，其中多態性條帶75條，多態性比例為55.15%，說明供試樣品的遺傳多樣性較低。每條引物可擴增出6～15條帶，平均9.01條；產物條帶介于250～2200 bp，以400～1500 bp居多（圖1和表2）。

2. 2 相似系數分析結果

用NTsys 2.10計算出15條ISSR引物擴增結果在不同種質間的相似系數，平均遺傳相似性系數為0.875。DX2與JZ5的相似系數最小，為0.769，與兩者果形及其他表型性狀上存在較大差異相吻合；TD1與TD4的相似系數最大，為0.942，兩者在形態上較相似。

2. 3 聚類分析結果

用UPGMA構建50份山黃皮種質的分子系統樹（圖2），從聚類分析圖可以看出，不同山黃皮種質間的親緣關系較復雜。在相似系數0.864處，可將50份山黃皮種質分成A、B兩大組。A組包含40份種質，可分2個亞組：第I亞組包含28份種質，其中16份種質來自龍州縣，7份種質來自寧明縣，5份種質來自憑祥市；第II亞組包含12份種質，其中6份種質來自江州區，4份種質來自扶綏縣，2份種質來自寧明縣。B組包含10份種質，可分2個亞組：第I亞組包含8份種質，其中4份種質來自天等縣，4份種質來自大新縣；第II亞組包含2份種質，均來自大新縣。

2. 4 主成分分析結果

應用NTsys 2.10在遺傳相似系數矩陣基礎上對50份山黃皮種質資源進行主成分分析，前三主成分貢獻率依次為12.11%、8.73%和7.68%，累積貢獻率為28.52%，可以代表原始數據的主要信息。從二維聚類圖（圖3）可看出，50份山黃皮種質可分為A、B兩個群體，與聚類分析結果基本一致；供試山黃皮種質占的空間較小，分布較均勻，表明其遺傳背景較狹窄，遺傳基礎較一致。

3 討論

崇左市位于廣西西南部，地跨東經106°33′～108°6′、北緯21°36′～23°22′，地形以山地為主，海拔在79.4～1358.0 m，其山黃皮種質資源豐富，很多地方仍保存著野生居群。黃皮屬有30多個種，黃皮和山黃皮是其中的兩個栽培種（李開拓，2008；劉冰浩等，2014）。目前對黃皮屬的遺傳多樣性研究多為黃皮栽培種，而關于山黃皮遺傳多樣性的研究鮮見報道。姜燕等（2005）對黃皮和山黃皮的染色體進行分析，發現這兩個種均為二倍體，染色體數目為18，核型類型相同，親緣關系較接近。王惠君等（2015）對24份廣西黃皮種質資源進行分析，在遺傳相似系數0.718處將黃皮種質分為三大組，第Ⅰ和第Ⅱ組為黃皮種的不同品種，第Ⅲ組為山黃皮種，山黃皮種和黃皮種間的最小遺傳相似系數為0.660。也有研究結果表明，黃皮種的不同品種間親緣關系較近，如劉小梅等（2007）對36個黃皮基因組DNA進行RAPD擴增，結果表明，大多數黃皮種質相似系數在0.90～0.97，親緣關系較近；蔣素梅等（2008）對14個黃皮品種（系）進行RAPD分析，結果表明，大多數黃皮品種（系）間遺傳差異較小，遺傳距離為0.025～0.300，遺傳基礎較狹窄；李開拓等（2009b）采用ISSR分子標記技術對40份黃皮種質進行遺傳多樣性分析，結果表明，供試的黃皮品種間平均遺傳相似系數高達0.841，遺傳多樣性很低。本研究采用ISSR分子標記可將供試的50份山黃皮種質資源區分開，從ISSR分析獲得的遺傳相似系數來看，大部分山黃皮種質相似系數在0.860以上，遺傳相似性較大，親緣關系也較近，說明供試的山黃皮種質遺傳多樣性較低，可能與取材范圍較狹窄有關。

本研究中，來自崇左市北部的大新縣和天等縣的山黃皮種質被歸到一組，來自龍州縣、寧明縣、江州區、憑祥市、扶綏縣的種質被歸到另一組；來自崇左市西南部的龍州縣、寧明縣和憑祥市的種質被歸到同一亞組，來自崇左市中部的江州區和東部的扶綏縣的種質被歸到同一亞組，說明山黃皮種質資源的親緣關系與地理起源有一定的相關性。桂研20號與來自龍州縣、寧明縣和憑祥市的種質親緣關系比較接近，可能與品種選育的親本來源較近和山黃皮資源的基因交流有關。有少量的山黃皮種質間存在較大的遺傳差異，如DX2和JZ5的遺傳距離為0.769，NM9和TD1的遺傳距離為0.788，其在果形、葉形等表型性狀上也存在較明顯差異。因此，這些在形態和遺傳上差異較大的種質可作為山黃皮單株選育、良種繁育等研究的重要材料。

4 結論

本研究結果表明，廣西崇左市山黃皮種質資源較豐富，大部分山黃皮種質親緣關系較接近，且與地理起源有一定的相關性，NM9、TD1、DX2和JZ5等遺傳差異較大的種質可作為山黃皮優良品種和單株選育及良種繁育等研究的重要材料。

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（責任編輯 羅 麗）