廣西毛葡萄產區野生葡萄酒酵母種群分布與系統進化分析

楊瑩 管敬喜 謝林君 張勁 文仁德 成果

摘要：【目的】對廣西毛葡萄產區野生葡萄酒相關酵母菌的種類進行鑒定及分布研究，明確毛葡萄產區主要酵母種類及分布規律，為當地釀酒酵母資源的開發利用打下基礎?！痉椒ā繌钠咸压麑嵄砻婧凸麑嵶匀话l酵汁中分離、純化野生葡萄酒相關酵母，利用WL培養基對分離獲得的酵母菌株進行分類，從每一類型中選取代表菌株進行26S rDNA 基因測序鑒定并進行系統進化分析?！窘Y果】從葡萄果實表面及自然發酵汁中共分離獲得180株酵母菌株，根據菌株在WL培養基上的顏色及菌落形態差異將180株酵母菌歸為5類。26S rDNA基因序列分析結果表明，20株代表菌株分屬于6個屬9個種，分別為：漢遜酵母屬的Hanseniaspora thailandica、H. opuntiae、H. occidentalis和H. guilliermondii；畢赤酵母屬的Pichia pastoris；伊薩酵母屬的Issatchenkia terricola；釀酒酵母屬的Saccharomyces cerevisiae；Saturnispora屬的S. diversa和紅酵母屬（Rhodutorula，未鑒定到種）。葡萄汁自然發酵過程中由H. thailandica啟動發酵， 隨后出現H. thailandica、H. opuntiae、H.occidentalis、H. guilliermondii和S. diversa，最后由S. cerevisiae逐漸主導并控制發酵?！窘Y論】在廣西都安縣毛葡萄產區生態環境中存在6個屬9個種的葡萄酒相關酵母菌，其中H. guilliermondii是毛葡萄果表優勢酵母菌種；在毛葡萄自然發酵汁中存在漢遜酵母的4個不同種及S. diversa和S. cerevisiae，隨著發酵環境的變化此消彼長。

關鍵詞： 毛葡萄；葡萄酒相關酵母；種群分布；系統發育進化樹；廣西都安縣

中圖分類號： Q938.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1123-06

0 引言

【研究意義】葡萄酒相關酵母是指在葡萄生長和種植區域的自然環境中存在的與葡萄酒生產相關的酵母菌種，具體包括非釀酒酵母屬及酵母屬的一些種。迄今為止，在葡萄果表、葡萄汁及葡萄酒廠中發現的酵母菌已有24個屬120個種，幾乎遍及酵母的主要屬種，這些酵母菌由于長期存在于特定的自然條件及環境中，在繁衍過程中逐步適應當地的品種特點、氣候條件及土壤特征，從而獲得了有別于其他地域的代謝特征。這些具有本土特征的酵母菌在葡萄酒發酵過程中會帶給葡萄酒獨特的感官和風味，賦予葡萄酒獨有的地域特征（Dubourdieu et al.，2006；Christian et al.，2007）。因此，利用本土酵母是解決目前國內葡萄酒質量趨同、風格單一的有效辦法；同時，調查研究本土野生酵母菌的種類和分布進化規律，是開展野生釀酒酵母篩選、改良及加工應用工作的基礎?！厩叭搜芯窟M展】自1860年巴斯德發現酒精發酵是由酵母菌的作用而產生以來，人類對酵母的利用及研究就從未間斷。Harry等（2003）對葡萄及葡萄園中酵母種群結構的研究結果表明，漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、紅酵母屬（Rhodotorula）和克魯維酵母屬（Kluyveromyces）是存在于葡萄園中的優勢菌種。Torija等（2001）連續3年觀察西班牙普里奧拉托和特拉阿爾塔葡萄酒產區葡萄自然發酵種酵母種群變化，發現非釀酒酵母屬的星型假絲酵母（Candida stellata）、軟假絲酵母（Candida colliculosa）、葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）、拜耳接和酵母（Zygosaccharomyces bailii）和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）在發酵前期占主導地位，但在發酵中后期釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是主導酵母。Harry等（2003）研究了美國俄亥俄州伊利湖地區葡萄自然發酵中的酵母種群，指出檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）和葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）是存在于本土的主要菌種，其次是梅氏酵母（Metschnikowia）、假絲酵母（Candida）、畢赤酵母（Pichia）、漢遜酵母（Hansenula）。Rementeria等（2003）和Belén Suáre等（2007）研究發現，在葡萄汁的自然發酵過程中，非釀酒酵母屬的菌種由于對酒精耐受的生理特性不同，此消彼長，最終逐步被釀酒酵母（S.cerevisiae）所替代；同時，Pretorius（2000）指出，S. cerevisiae幾乎從未從健康果實表面和葡萄園土壤中分離得到。S. cerevisiae在葡萄上沒有發現，但存在于酒廠設備上。隨著阿根廷、智利等葡萄酒新世界國家的興起，這些地區也越來越重視本土酵母種群的研究和應用。Mercado和Combina（2010）研究了阿根廷釀酒葡萄園中釀酒酵母的基因多樣性，從自然發酵的葡萄汁中分離出商業酵母菌株，指出商業酵母已普遍存在于葡萄園生態中。巴西學者Milla等（2011）分離鑒定了本土葡萄園的葡萄酒相關酵母，發現H. uvarum、東方伊薩酵母（Issatchenkia occientalis）是當地的優勢菌種，同時還分離到S. cerevisiae、出芽短梗霉（類酵母）（Aureobasidium pullulans）和鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）。Díaz等（2013）在智利的葡萄自然發酵汁中分離鑒定出9個種的酵母菌，并發現美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、畢赤克魯維酵母（P. kluyveri）、畢赤膜酵母（P. mem-

branifaciens）及S.cerevisiae在發酵末期仍然存在。近10年來我國也陸續開展了不同產區釀酒微生物的生態調查及品種鑒定研究。劉愛國等（2008）、王澤舉等（2008）、王國平等（2009）、孫卉卉等（2009）從不同產區分離鑒定出的葡萄酒相關酵母菌種大致相同，但不同地區，特別是氣候類型差異較大的地區釀酒微生物種群存在較大差異?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內外對葡萄酵母群落的研究主要集中在人工管理種植的葡萄園中，對于野生葡萄生態環境中酵母菌群落的研究報道很少。廣西都安是中國野生毛葡萄起源地之一，據調查都安縣現有野生毛葡萄60261株，覆蓋面積達234.5 ha（3517畝）（王甲佳，2009；吳代東等，2015），且野生毛葡萄生長區相對封閉，地域特征明顯，因此，當地應存在豐富的葡萄酒酵母資源及相對獨立的酵母進化發展歷程?！緮M解決的關鍵問題】通過對廣西毛葡萄產區野生葡萄酒相關酵母種類的調查研究及進化分析，探明存在于毛葡萄起源地區葡萄酒相關酵母的主要種類及分布規律，初步探索該地區葡萄酒相關酵母進化進程，為當地釀酒酵母資源的開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試葡萄漿果采集于廣西河池市都安瑤族自治縣青盛鄉樹齡50年以上的野生毛葡萄植株。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 果表酵母分離 在葡萄成熟期（8月31日～

10月6日）采集葡萄漿果，將果粒置于滅菌生理鹽水中振蕩10 min，將溶有酵母菌的生理鹽水稀釋至適當梯度（10-4～10-2），取1.0 mL，涂布于YPD培養基（加氯霉素100 mg/L以抑制細菌生長）上，28 ℃富集培養2～3 d，記錄菌落形態特征、菌落個數，然后挑取單個菌落，以劃線方式在YPD培養基上分離純化。

1. 2. 2 自然發酵汁酵母分離 將成熟果粒破碎，帶皮進行自然發酵。自然發酵汁分別采用40 mg/L SO2處理和不加SO2處理，待發酵啟動后，每天取1.0 mL發酵液（連續8 d），稀釋至適當梯度（10-3～10-4），涂布于YPD培養基，28 ℃富集培養2～3 d，隨機挑取單個菌落10～15個（選取計數的培養皿菌落應控制在30～300個），以劃線方式在YPD培養基上分離純化。28 ℃培養箱中富集培養72 h。

1. 2. 3 菌株保藏 將純化后的單菌株在YPD液體培養基中活化1 d，將活化的菌液與30%無菌甘油以1∶1混合于1.5 mL離心管中，-70 ℃下保藏。

1. 2. 4 WL營養瓊脂聚類分析 采用WL培養基對收集到的酵母菌株進行初步分類：將保藏的菌株活化后劃線接種于WL營養瓊脂培養基，28 ℃培養5 d后， 觀察記錄菌落的顏色和形態，根據菌落不同表現特征對菌株進行初步歸類（Cavazza et al.，1992）。

1. 2. 5 代表菌株26S rDNA D1/D2區序列擴增及測定 采用石英砂破壁法提取菌株總DNA。挑取YPD培養基上生長良好的單菌落于200 μL的裂解液中（50 mmol/L Tris-HCI，180 mmol/L EDTA，1%SDS），加入3/10體積的石英砂振蕩15～18 min；65 ℃水浴10 min，加200 μL 3 mol/L醋酸鉀冰浴8 min，14000 r/min離心5 min，取上清液；加入3 mol/L醋酸鈉35 μL、異丙醇200 μL，冰浴8 min，14000 r/min離心5 min，收集沉淀；用200 μL TE溶解沉淀，加入10 μL RNA酶，65 ℃水浴10 min；取上清液，加0.1倍體積的3 mol/L醋酸鉀及375 μL無水乙醇，以最大速離心8 min，收集DNA；70%乙醇洗滌，離心，抽干；加50 μL TE溶解。

26S rDNA D1/D2 PCR擴增：擴增引物為26S NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。使用TAKARA

MightyAmp DNA Polymerase Ver.2（R071Q）進行PCR擴增。PCR反應體系（50.0 μL）：2×MightyAmp Buffer Ver.2 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol），MightyAmp DNA Polymerase 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 21.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，進行30個循環，4 ℃保存。

1. 2. 6 測序分析 PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果查詢GenBank數據庫，采用BLAST在線工具進行相似性比較。

1. 2. 7 葡萄汁自然發酵前后酸度測定 采用酸堿滴定法進行測定。

2 結果與分析

2. 1 野生菌株的WL聚類分析及測序鑒定結果

分別從果實表面及自然發酵汁中收集到50和130株酵母菌株。將收集到的180株酵母菌重新活化，涂布于WL培養基上，根據菌株在WL培養基上的顏色及菌落形態差異將180株酵母菌歸為5類，具體菌落特征描述見表1。不同菌種在YPD培養基上的形態特征見圖1。

根據WL培養基聚類分析結果，分別從5個類型菌株中挑選代表菌株，共挑選20株菌株進行26S rDNA D1/D2基因序列分析。測序結果查詢GenBank數據庫，采用BLAST在線工具進行相似性比較。測序鑒定結果表明，20株代表菌株分屬于6個屬9個種，分別是漢遜酵母屬的H.thailandica、H.opuntiae、H.occidentalis和H.guilliermondii；畢赤酵母屬的P. pastoris；伊薩酵母屬的I. terricola；釀酒酵母屬的S.cerevisiae；Saturnispora屬的S. diversa和紅酵母屬（Rhodutorula，未鑒定到種）。

2. 2 葡萄漿果表面野生酵母種類分布情況

從果表采集到的50株菌株中選取30株代表菌株進行聚類分析，結果發現，30株菌株分屬于4個屬的4個種，分別是季也蒙有孢漢遜酵母（H. guilliermondii）、東方伊薩酵母（I. terricola）、巴斯德畢赤酵母（P. pastoris）和紅酵母（Rhodutorula），分別占果表分離菌總數的61.53%、23.07%、7.70%和7.70%。

2. 3 自然發酵過程中野生酵母種類及動態變化

對毛葡萄自然發酵過程中菌種變化的監測發現，最初由漢遜酵母（H. thailandica）啟動發酵。自然發酵前2 d只分離得到一種菌落形態的酵母菌，從自然發酵第2 d起分離出不同種的漢遜酵母，包括H. thailandica、H. opuntiae、H. occidentalis和H. guilliermondii，同時還分離得到S. diversa；到發酵第5 d開始分離出少量釀酒酵母（S. cerevisiae），隨后S. cerevisiae比例增多，第8 d分離出的全部為S. cerevisiae（圖2）。在整個發酵過程中共分離出漢遜酵母屬、Saturnispora屬及釀酒酵母屬，其中漢遜酵母屬有4個種均出現在發酵汁中。

2. 4 代表菌株測序結果及種群系統進化分析結果

選取12個菌株的26S rDNA序列采用ML分析法構建系統發育進化樹，系統進化分析樹狀譜如圖3所示。

由圖3可知，12個菌株可分為4個遺傳類群。第1分支中包括MSF6-1、MSF6-6、MSF1-4和MG3，其中前3種為同一種菌（H. thailandica），在系統發育進化樹中也表現出其同種可靠性為100%，MG3為伊薩酵母（I. terricola），表明MG3與MSF6-1、MSF6-6和MSF1-4有較近的同源關系。第2分支中包括MSF8-1、MG4、MG7和MSF1-6，其中后3個菌株為同一種菌（H. guilliermon-

dii），MSF8-1為釀酒酵母（S. cerevisiae）；第3分支包括MSF6-2、MG2和MG6，測序結果表明3個菌株為漢遜酵母屬下的3個不同種，分別為H. occidentalis、 H. thailandica和H. opuntiae；最后一個分支MG1為畢赤酵母屬的P. pastoris。

按遺傳距離分析，第1分支和第4分支遺傳距離較長，第2分支和第3分支遺傳距離較短，表明在這些菌株的進化過程中，第2、第3分支進化地位較古老，第1、第4分支進化地位較新。

3 討論

3. 1 廣西毛葡萄產區野生酵母菌生態分布

本研究中分離出的野生毛葡萄果實表面酵母菌種類與國內外大部分研究結果一致，主要為漢遜酵母、畢赤酵母、伊薩酵母及紅酵母，但未分離得到葡萄園常見的Candida酵母屬、Metschnikowia和kloeckera等葡萄酒相關酵母。長期的研究結果表明，葡萄園的酵母菌種類與氣候、土壤、環境及葡萄園管理密切相關。Torija等（2001）連續3年觀察西班牙普里奧拉托和特拉阿爾塔葡萄酒產區葡萄自然發酵種酵母種群變化，指出酵母群的種類與地理氣候條件有關，每年都有微小的變化，但與葡萄酒類型、起源及分離年份無關。焦紅茹（2008）通過對不同品種葡萄相關酵母的分離與分類鑒定也發現，不同種葡萄表面酵母分布與發酵汁中酵母變化大同小異。由此說明氣候及生態環境是影響酵母種群分布的主要因素。本研究中供試材料來源于廣西都安毛葡萄產區，該地區是典型的喀斯特巖溶地貌山區，屬亞熱帶季風氣候區，夏季高溫高濕，冬季干旱少雨，與其他產區相比具有明顯差異。從本研究中分離出的果表酵母種類較少，且在種上也與其他研究結果有一定差別。

3. 2 自然發酵過程中酵母菌的種類及變化

本研究在自然發酵過程中共分離獲得3個屬的6種酵母菌，分別為漢遜酵母屬的H. guilliermondii、H. thailandica、H. occidentalis、H. opuntiae，Saturnispora屬的S. diversa和釀酒酵母屬的S. cerevisiae。由H. guilliermondii啟動發酵，隨后出現同屬的其他種，到發酵中后期由S. cerevisiae逐漸主導并完全控制發酵。而在新疆、甘肅及河北等產區的自然發酵葡萄汁中占主導的菌種為H. uvarum，同時在發酵初期普遍分離得到M. pulcherrima、H. uvarum、P. kluyverivar和I. orientalis等菌種（劉愛國等，2008；王澤舉等，2008；孫卉卉等，2009；王國平等，2009）。在本研究中分離到的S. diversa菌為國內首次報道，該菌主要分布在熱帶地區，曾在印度尼西亞（Uchiyama et al.，1995）、巴西（Morais et al.，2005）的熱帶雨林被分離到。

毛葡萄具有糖低酸高的顯著特點（鄒瑜等，2012；陳潔梅等，2014），對一些種酵母具有選擇淘汰作用。為初步判定毛葡萄生境中野生酵母是否具有代謝酸的特征，本研究檢測了發酵汁前后的總酸值。本研究中發酵初期的葡萄汁酸度為28.35 g/L，自然發酵結束后發酵汁總酸降為25.70 g/L，酸度降低了2.65 g/L；同時，果表酵母中除H. guilliermondii外，其他菌株均未在發酵汁中出現，而S. cerevisiae在自然發酵后期出現并占主導地位?？梢?，漢遜屬酵母對葡萄汁酸度具有較高的耐受性，S. cerevisiae可能具有較強的酸代謝能力。

3. 3 廣西都安野生葡萄酒酵母菌系統進化關系

本研究中分離出的與發酵密切相關的漢遜酵母、畢赤酵母、伊薩酵母和釀酒酵母的12株酵母菌可分為4個遺傳類群，4個不同種的漢遜屬酵母位于3個不同分支上，其中同屬于漢遜酵母屬的H. thailandica與其他分離出的漢遜屬酵母不在同一分支上，但與MG3（I.terricola）具有較近的親緣關系。本研究中的S. cerevisiae與H. guilliermondii在同一分支上，具有較近的親緣關系，同時該兩種菌株均為發酵過程中的優勢菌種。因此，對于廣西野生毛葡萄產區的葡萄酒相關酵母的種間關系及遺傳起源還應進行更深入的研究。

4 結論

本研究通過對廣西野生毛葡萄產區生態環境中葡萄酒相關酵母種類的調查及分類鑒定，共分離得到6個屬9個種的葡萄酒相關酵母，分別為漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、釀酒酵母屬、紅酵母屬及Saturnispora屬，其中漿果表面分離得到H. guilliermondii、P. pastoris、I. terricola和Rhodutorula，H. guilliermondii為葡萄果表優勢種；從自然發酵汁中分離得到漢遜酵母屬的4個不同種、Saturnispora屬和釀酒酵母，由漢遜酵母H. thailandica啟動發酵，最后由S. cerevisiae主導并控制發酵；發酵汁中的漢遜酵母具有較強的耐酸及嗜酸能力。

參考文獻：

陳潔梅，繆冰旋，張燦輝，王琳歡，艾田. 2014. 野生葡萄及葡萄酒抗氧化活性和抗菌性研究[J]. 廣西植物，34（4）：510-514.

Chen J M，Miao B X，Zhang C H，Wang L H，Ai T. 2014. Antioxidant activity and antibacterial property of wild grape and grape wine[J]. Guihaia，34（4）：510-514.

焦紅茹. 2008. 不同釀酒葡萄品種相關酵母菌的分離及分類鑒定[D]. 楊凌：西北農林科技大學.

Jiao H R. 2008. Isolation and identification of wine-related yeast associated to different varieties[D]. Yangling： Northwest A & F University.

劉愛國，劉延琳，王澤舉. 2008. 寧夏葡萄自然發酵過程中酵母菌的分子生物學鑒定[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），36（11）：203-207.

Liu A G， Liu Y L， Wang Z J. 2008. Molecular identification of wild wine-related yeasts isolated spontaneous wine fermentation in Ningxia district[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition）， 36（11）：203-207.

孫卉卉，陳尚武，李德美. 2009. 云南彌勒產區水晶葡萄醪中酵母菌多樣性的研究[J]. 云南大學學報（自然科學版），31（1）：103-108.

Sun H H， Chen S W， Li D M. 2009. Yeast isolation and identification from crytal must of mile wine region， Yunnan province[J]. Journal of Yunnan University，31（1）：103-108.

王國平，宋育陽，裴穎芳. 2009. 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒廠野生酵母菌株的分離篩選及分子鑒定[J]. 中國釀造，（8）：38-41.

Wang G P， Song Y Y， Pei Y F. 2009. Isolation and molecular identification of wild wine-related yeasts from winery of east Helan mountion in Ningxia province[J]. China Brewing，（8）：38-41.

王甲佳. 2009. 廣西都安野生毛葡萄資源調查與樹齡鑒定方法的研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學.

Wang J J. 2009. Study on wild Vitis quinquangularis Rehd. resource investigation and tree age identification in Duan （Guangxi district）[D]. Yangling： Northwest A & F University.

王澤舉，劉延琳，劉愛國. 2008. 新疆葡萄酒自然發酵過程酵母菌的種類和動態變化[J]. 華中農業大學學報，27（5）：664-667.

Wang Z J， Liu Y L， Liu A G. 2008. Survey on yeast population dynamics during wine spontaneous fermentation in Xinjiang[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，27（5）：664-667.

吳代東，姚寧，李乃流，覃柳燕，吳艷艷，牟海飛，李偉，蔣代華.2015. 優化施肥對南方丘陵山地毛葡萄產量效益的影響[J]. 西南農業學報，28（5）：2172-2175.

Wu D D，Yao N，Li N L，Qin L Y，Wu Y Y，Mou H F，Li W，Jiang D H. 2015. Effect of optimized fertilization on yield and economic benefit of Vitis quinquangularis Rehd. in hills and mountains of southern China[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（5）：2172-2175.

鄒瑜，吳代東，牟海飛，林貴美，李小泉，張進忠，歐昆鵬. 2012. 廣西野生毛葡萄種質資源性狀評價[J]. 中國農學通報，28（4）：283-287.

Zou Y， Wu D D， Mou H F， Lin G M， Li X Q， Zhang J Z， Ou K P. 2012. The evaluation of gerplasm traits of wild grape（Vitis quinquangularis Rehd.） in Guangxi[J]. Chinese Agriculture Science Bulletin，28（4）： 283-287.

Belén Suáre V， Rosa P B， Norman F T， Amparo Q S， Robert R M. 2007. Yeast species associated with the spontaneous fermentation of cider[J]. Food Microbiology， 24（1）： 25-31.

Cavazza A， Grando M S， Zini C. 1992. Rilevazione della flora microbicadi mosti e vini[J]. Vignevini，9： 17-20.

Christian A L， María E R，Marcela S. 2007. Patagonian wines： implantation of an indigenous strain of Saccharomyces cerevisiae in fermentations conducted in traditional and modern cellars[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnolo-

gy， 34（2）：139-149.

Díaz C，Molina A M，N hring J，Fischer R. 2013. Characterization and dynamic behavior of wild yeast during spontaneous wine fermentation in steel tanks and amphorae[J]. Biomed Research International，（2）：354-355.

Dubourdieu D， Tominaga T， Masneuf I， Peyrot des Gachons C， Murat M L. 2006. The role of yeasts in grape flavor deve-

lopment during fermentation： the example of Sauvignon blanc[J]. American Journal of Enology & Viticulture， 57（1）： 1.

Harry V K， Donald G， Lindmark B， Kathleen E， Wes G. 2003. Yeasts present during spontaneous fermentation of Lake Erie Chardonnay， Pinot Gris and Riesling[J]. Antonie Van Leeuwenhoek， 83（2）： 149-154.

Mercado L， Combina M. 2010. Exploring the biodiversity of a wine region： Saccharomyces yeasts associated with wineries and vineyards[J]. Current Research， Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology， 2010：1042-1053.

Milla A B， Carolina S B， María A-V， Ana I B， Eleni G， Roberto D S. 2011. Isolation and molecular identification of wine yeasts from a Brazilian vineyard[J]. Annals of Microbiology， 61（61）：75-78.

Morais P B， Marc-André L， Rosa C A. 2005. Saturnispora hagleri sp. nov.， a yeast species isolated from Drosophila flies in Atlantic Rain Forest in Brazil[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology， 55（4）：1725-1727.

Pretorius I S. 2000. Tailoring wine yeast for the new millennium novel approaches to the ancient art of winemaking[J]. Yeast， 16（8）：675-729.

Rementeria A，Rodriguez J A，Cadaval A，Amenabar R，Muguruza J R，Hernando F L，Sevilla M J. 2003. Yeast associated with spontaneous fermentations of white wines from the “Txakoli de Bizkaia” region（Basque Country， North Spain）[J]. International Journal of Food Microbiology， 86（1-2）： 201-207.

Torija M J，Rozès N，Poblet M，Guillamón J M，Mas. 2001. Yeast population dynamics in spontaneous fermentations comparison between two different wine-producing areas over a period of three years[J]. Antonie Van Leeuwenhoek， 79（3-4）： 345-352.

Uchiyama S， Kamiya S， Udagawa S I. 1995. Spiromastix saturnispora， a new species from Indonesian soil[J]. Mycoscience， 36（3）： 353-357.

（責任編輯 麻小燕）