草莓炭疽菌初期侵染過程顯微觀察

趙玳琳 卯婷婷 趙興麗 劉杏忠 蔡磊 陶剛

摘要：【目的】明確草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）在侵染草莓葉片過程中病原菌的侵染致病過程，為防控草莓炭疽病提供理論依據?！痉椒ā坑貌葺烤揖G色熒光蛋白標記菌株LC0220-7GFP的分生孢子懸浮液接種離體健康草莓葉片，在熒光顯微鏡下觀察病原菌的侵染過程及侵染結構?！窘Y果】接種6～9 h為病原菌分生孢子萌發高峰期，接種9 h約90.00%的分生孢子已萌發；接種12～24 h為侵染結構形成高峰期，接種24 h約70.00%的芽管頂端產生附著胞并形成侵染釘開始侵染草莓葉片表皮細胞，有少量的菌絲開始直接侵染葉片表皮細胞，同時在寄主上表皮上有少量的附著枝形成；接種48 h為菌絲形成高峰期，菌絲大量形成并沿著表皮細胞延伸成網絡狀，葉片開始出現零星病斑；接種72～96 h為分生孢子盤形成高峰期；接種96～120 h為產孢高峰期，接種96 h產生新的分生孢子，大部分病原菌完成一個侵染循環；接種144 h形成典型的炭疽病斑?！窘Y論】草莓炭疽菌通過產生附著胞侵入或直接侵入草莓葉片表皮細胞，使草莓葉片發病，形成典型的炭疽病斑。

關鍵詞： 草莓炭疽菌；附著胞；熒光顯微鏡；侵染釘；侵染過程

中圖分類號： S436.639 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1140-06

0 引言

【研究意義】草莓炭疽病是草莓種植業的重要病害之一，其發生普遍，分布廣泛，已成為繼灰霉病和白粉病后制約我國草莓生產的第三大病害（陳宏州等，2014），近年來草莓炭疽病的發生呈上升趨勢（楊敬輝等，2015）。據法國Denoyes和Baudry（1995）報道，適宜條件下草莓炭疽病最高可造成草莓減產80%；在我國，隨著草莓種植面積的擴大，設施密閉及高溫高濕環境等導致草莓炭疽病發生日益嚴重，造成草莓減產25%～30%，嚴重影響草莓的產量和品質（胡德玉等， 2014）。因此，盡快明確草莓炭疽病病原菌的侵染致病特征，對于尋求新的炭疽病病害防治策略，開發新的病害安全控制體系等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】草莓炭疽病由多種炭疽菌（Colletotrichum Corda）復合侵染引起，已有文獻報道的病原菌包括尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmonds）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz）、草莓炭疽菌（C. fragariae Brooks）和黑線炭疽菌（C. dematiu Simmonds）（Gunnell and Gubler， 1992； Denoyes-Rothan et al.， 2003）。1931年Brooks在美國佛羅里達州首次報道由草莓炭疽菌引起的草莓炭疽病。草莓炭疽菌一般情況下習慣性侵染草莓莖稈，引起草莓炭疽冠腐?。–urry et al.， 2002）。多年來，草莓炭疽菌雖然在病原菌種類鑒定、病原菌生物學特性、為害癥狀及檢測技術等方面有較多研究報道，但關于草莓炭疽病菌致病機制及其調控的研究僅限于零散報道（Howard and Albregts， 1983； Bonde et al.，1991；Sreenivasaprasad et al.，1992； Freeman et al.， 1993；Curry et al.，2002；Martinez-Culebras et al.，2002， 2003；Fang et al.，2012），僅Curry等（2002）首次應用光學顯微鏡和透射電鏡在細胞組織水平上觀察草莓炭疽菌侵染草莓莖稈的過程和Fang等（2012）對草莓炭疽菌侵染草莓莖稈過程中蛋白質組學變化進行了相關研究?！颈狙芯壳腥朦c】相對于傳統的電鏡技術，綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）標記系統由于熒光性能穩定、檢測方便、靈敏度高及表達不受種屬限制等特性而越來越為人們重視，并被成功地用于研究細菌、真菌在植物根部、體內的定殖觀察（Ramos et al.， 2002； 陳孝仁等， 2009；趙鳳軒， 2010）及工程菌向環境的釋放（Scott et al.，1998；Halfhill et al.， 2001）等研究，應用GFP標記菌株觀察病原菌在寄主體內的侵染過程，對病害過程進行實時動態追蹤，將是未來重要的研究方向之一。目前，尚無應用GFP標記體系觀察草莓炭疽菌侵染過程的報道?！緮M解決的關鍵問題】用草莓炭疽菌（C. fragariae）綠色熒光蛋白標記菌株LC0220-7GFP的分生孢子液離體接種草莓葉片，在熒光顯微鏡下對其侵染致病過程及侵染結構等進行初步觀察，旨在明確該病原菌在侵染草莓葉片過程中病原菌的侵染致病過程，為進一步揭示草莓炭疽病病害的發生、發展規律打下理論基礎，同時為有效防治提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 草莓炭疽GFP標記菌株：LC0220- 7GFP，野生型菌株由中國科學院微生物研究所饋贈，熒光菌株通過ATMT遺傳轉化方法獲得，于PDA斜面培養基上4 ℃條件下保存備用。

1. 1. 2 供試草莓品種 黔莓2號，草莓葉片采集于貴州省農業科學院園藝所大棚，用滅菌剪刀剪取大小均勻、生長周期較一致的健康草莓葉片若干備用。

1. 1. 3 供試培養基 培養基參考方中達（1998）的方法。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯 200 g切片，放入1000 mL水煮沸，約30 min后用4層紗布過濾得濾液，加葡萄糖20 g、瓊脂15 g，用玻璃棒混勻，加水定容至1000 mL。

1. 1. 4 分生孢子懸浮液制備 將于PDA斜面培養基上4 ℃保存的菌株LC0220-7GFP轉移至PDA培養基，置于25 ℃培養箱內黑暗條件下培養5 d，用滅菌打孔器于菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅若干，將菌餅再次移至PDA培養基中，再次放入25 ℃培養箱內黑暗條件下培養7 d，病原菌在PDA培養基上大量產孢，然后在每個培養皿中加入5 mL無菌水，用滅菌玻璃棒刮取表面菌絲，經4層滅菌過濾紙過濾得到分生孢子濾液。用血球計數板計算分生孢子液濃度，通過離心濃縮或加入無菌水稀釋等方法將溶液調整成濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液。為提高分生孢子液在葉片上的黏著性，在接種前加入數滴Tween-20原液，Tween-20最終濃度為0.1%。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 葉片接種方法 于大棚內用滅菌剪刀剪取大小均勻、生長周期較一致的健康草莓葉片100片，用無菌水沖洗3遍，75%酒精表面消毒，消毒后的葉片整齊放置于鋪有濕潤吸水紙的搪瓷盤中（搪瓷盤先用75%酒精噴灑消毒，鋪4層吸水紙，然后噴灑無菌水使吸水紙保持濕潤），用無菌水濕潤后的濕棉花壓住葉柄，確保葉片能長時間保持新鮮。用滅菌槍頭吸取制備好的濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液接種于草莓葉片上，每片葉片接種500 μL，用滅菌后的小刷子均勻地涂抹于草莓葉片上，以噴灑無菌水為空白對照。接種后用保鮮膜封口，置于28 ℃、濕度90%、14 h光照/10 h黑暗的培養箱中培養。

1. 2. 2 取樣和顯微觀察方法 在接種不同時間點（接種后3、6、9、12、24、48、72、96、120、144 h）取樣，每時間點隨機取樣6片葉片。用滅菌刀片將葉片切成若干小薄塊制作成臨時水裝片，臨時水裝片置于熒光顯微鏡下進行觀察、拍照，并統計分生孢子萌發和附著胞形成的時間點和百分率，孢子萌發和附著胞產生每次隨機統計30個孢子，3次重復。顯微鏡設置：Diode/Argon/HeNe1- HeNe2激發光，綠色熒光通過488 nm濾鏡觀察。

1. 3 統計分析

參照萬三連等（2014）的方法對試驗數據進行統計分析。孢子萌發、附著胞形成比率計算公式：形成比率（%）=形成各結構孢子數/孢子統計總數×100。

2 結果與分析

2. 1 病原菌分生孢子在草莓葉片上的侵染過程及致病性

接種后3～24 h LC0220-7GFP分生孢子萌發及附著胞形成情況見表1。接種后分生孢子首先附著于葉片表面，接種6 h，25.00%的病原菌分生孢子開始從端部或近端部萌發出棒狀芽管（圖1-1），1個分生孢子能產生1～3根牙管（圖1-2）；接種9 h，約90.00%的分生孢子萌發；接種12 h，分生孢子萌發率為100.00%，約16.00%的芽管頂端開始膨大，分化成特異的侵染結構附著胞，此時的附著胞顏色較淺，尚未黑化，胞質較稀疏（圖1-3），部分芽管分化形成初生菌絲和次生菌絲（圖1-4）；接種24 h，可觀察到有少量的侵染菌絲直接侵染葉片表皮細胞（圖1-5），同時約70.00%的芽管產生大量的黑化附著胞，在一些附著胞基部觀察到有一黑色邊緣的小圓點，是附著胞分化形成的侵染釘，即黑化附著胞分化形成侵染釘開始穿透寄主表皮細胞進行侵染（圖1-6），且侵染菌絲已侵入葉片皮層細胞（圖1-7），同時有少量的菌絲分化形成附著枝（圖2-7～9）；接種48 h，菌絲呈網絡狀覆蓋于葉片表面，侵染菌絲在寄主皮層細胞間大量擴增（圖1-8），同時通過葉片腺毛組織細胞進行侵染（圖1-9），在葉片上出現肉眼可見的針尖大小病斑（圖1-13），發病率為100.00%，但空白對照葉片無病斑（圖1-14）；接種72 h，侵染菌絲迅速擴增，從1個細胞侵染擴散到周圍其他細胞，分生孢子盤開始萌發（圖1-10）；接種96 h，在葉片表面形成大量的分生孢子盤，分生孢子盤上的分生孢子梗產生新的分生孢子，大多數病原菌完成一個侵染循環（圖1-11）；接種144 h，葉片上許多小病斑相互連成大病斑或成一片，形成典型的炭疽病斑（圖1-15），葉片細胞開始大量腐爛崩解（圖1-12），而空白對照仍無癥狀（圖1-16）。

經過觀察可將草莓炭疽菌初期侵染草莓葉片過程分為幾個關鍵時期：6～9 h為分生孢子萌發高峰期；12～24 h為侵染結構形成高峰期；48 h為菌絲形成高峰期；72～96 h為分生孢子盤形成高峰期；96～120 h為產孢高峰期。

2. 2 病原菌侵染結構的超微觀察

當病原菌識別寄主后，在寄主表面開始萌發形成芽管并產生一系列的侵染結構：附著胞、附著枝、侵染釘、初生菌絲、次生菌絲等。在熒光顯微鏡下觀察，接種12 h開始形成附著胞，此時的附著胞顏色較淺，胞質較稀疏。24 h后附著胞分化成熟，胞壁逐漸黑色素化，胞質稠密，在附著胞基部形成1個圓形小點，即侵染釘，侵染釘穿透寄主角質層和細胞壁侵染寄主。接種24 h后在寄主上表皮上還可觀察到少量爪狀附著枝，附著枝尚未黑色素化（圖2-7～9）。

侵染結構有兩種形成方式：一是分生孢子端部產生芽管，芽管膨大產生附著胞或附著枝等；二是從菌絲上分化出側枝產生附著胞或附著枝等。顯微鏡觀察發現，LC0220-7GFP侵染草莓葉片能形成多種形態各異的附著胞，如圓形、姜瓣形、卵圓形、梨形、馬蹄形和不規則形等（圖2-1～6），同時，附著胞有多種著生方式，可以著生于芽管頂端（圖2-1、圖2-3），也可著生于菌絲分化的側枝頂端（圖2-2、圖2-5）。在觀察到的附著枝中，可以單個著生（圖2-7），也可形成多個爪狀的附著枝（圖2-8、圖2-9）。

3 討論

炭疽菌屬（C. Corda）是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均很廣泛，能嚴重危害多種瓜果蔬菜、苗木果樹等。該病菌分生孢子侵染途徑有兩種，一是通過自然孔口（氣孔、皮孔）或傷口入侵；另一種是必須依賴于病原菌獨特的侵染結構——附著胞（Appressorium）的直接侵入（王葵娣等，2007），在整個侵染過程中，附著胞的形成起著重要的致病作用。本研究觀察到草莓炭疽菌通過產生附著胞侵入寄主的同時，后期還能產生附著枝。一般情況下，一些土傳病原菌也能通過產生特殊的侵染結構——附著枝侵染寄主，如小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）（Mendgen et al.， 1996；Freeman and Ward， 2004；Sesma and Osbourn， 2004）。在前人的研究中尚未見草莓炭疽菌通過產生附著枝侵染寄主的報道。附著枝和附著胞在形成和結構上有許多相似之處，它們通常形成于相同的有機體上，但在特定條件下一般只有附著胞或附著枝單獨形成（Howard， 1997；Money et al.， 1998）。植物病原菌通常在進行腐生生活或被掩埋在土壤中時能形成附著枝，有學者認為此時附著枝扮演著附著胞入侵寄主的角色（Howard， 1997），也有人認為此時附著枝的形成可能是為了度過惡劣的生存環境，作為一種生存結構存在（Epstein， 1994）。Curry等（2002）報道， 草莓炭疽菌在經歷一個短暫的活體營養階段（小于12 h）后立即進入死體營養階段。本研究中，接種24 h后，草莓葉片上的病原菌菌絲能形成附著枝，病原菌可從已死亡的植物有機物中吸取養分進行腐生生活，此時附著枝可能是作為一種生存結構，成為下一個侵染循環或下一個生長季節再次侵染的侵染源。

炭疽菌屬真菌主要采用兩種侵染策略，即細胞內定殖和角質層下內部定殖（Perfect et al.， 1999），大多數炭疽菌屬于前者類型。草莓炭疽菌的侵染方式以胞內半活體營養寄生為主，與寄主建立了兩種營養關系：活體營養和死體營養（Connell et al.， 1985；張敬澤和徐同， 2005），即侵染初期無癥狀階段（或活體營養階段）和最后有明顯癥狀的危害階段。OConnell等（1985）和Leach（1922）描述區別無癥狀階段和危害階段的侵染菌絲為初生菌絲和次生菌絲，炭疽菌活體營養階段持續一段時間后，隨著初生菌絲上產生次生菌絲，活體侵染菌絲轉向死體營養階段，死體營養階段引起典型的炭疽病癥狀和枯萎癥狀。前人研究表明，草莓炭疽菌活體營養階段較短，一般少于12 h，之后次生菌絲產生比其更具有破壞性的次生菌絲，次生菌絲的產生標志著侵染進入死體營養階段（Curry et al.，2002）。本研究結果與上述報道相符，說明接種草莓炭疽菌12 h前該菌進行活體營養生長。

4 結論

本研究結果表明，草莓炭疽菌能在草莓葉片表面萌發形成一系列的侵染結構，如芽管、附著胞等，草莓炭疽菌通過侵染草莓葉片，使草莓葉片發病形成典型的炭疽病斑。

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（責任編輯 麻小燕）