凡納濱對蝦CTNNBL1基因克隆及表達分析

史黎黎 黎銘 章雙

摘要：【目的】明確CTNNBL1基因在凡納濱對蝦抗病過程中的功能作用，為深入探討對蝦抗病免疫機制提供參考依據?！痉椒ā坎捎肦ACE-PCR克隆凡納濱對蝦CTNNBL1基因（LvCTNNBL1），利用在線軟件進行生物信息學分析，并進一步分析其組織表達特征及應答白斑綜合征病毒（WSSV）和副溶血弧菌感染的表達模式?！窘Y果】LvCTNNBL1基因cDNA全長1906 bp，其中開放閱讀框（ORF）長1692 bp，編碼563個氨基酸，含有1個CTNNBL結構域。同源性分析發現LvCTNNBL1蛋白與大型溞（Daphnia magna）同源蛋白的相似度最高，為77%?；贑TNNBL1基因序列的系統發育進化分析結果顯示，凡納濱對蝦被聚為無脊椎動物一類，與同為節肢動物的大型溞、西方蜜蜂（Apis mellifera）和美洲鱟（Limulus polyphemus）的親緣關系較近。LvCTNNBL1基因在凡納濱對蝦中呈組成型表達，以在腸道中的表達量最高、表皮中的表達量最低。注射感染WSSV后，LvCTNNBL1基因在凡納濱對蝦血細胞中的表達量呈先下降后上升趨勢，在所有檢測時間點與對照組間存在顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01，下同）差異；注射感染副溶血弧菌后，LvCTNNBL1基因在凡納濱對蝦血細胞中的表達量呈先上升后下降趨勢，感染后12 h內較對照組極顯著升高?！窘Y論】LvCTNNBL1基因表達量在病毒和細菌感染時發生明顯變化，可能參與了凡納濱對蝦的抗病免疫途徑。

關鍵詞： 凡納濱對蝦；CTNNBL1基因；白斑綜合征病毒（WSSV）；副溶血弧菌；表達分析

中圖分類號： S945.46 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1203-06

0 引言

【研究意義】我國是世界對蝦養殖第一大國，養殖的對蝦品種有凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、斑節對蝦（Penaeus monodon）和日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）等，其中凡納濱對蝦是最主要的養殖品種（Li and Xiang，2013；曾地剛等，2014）。近年來，以白斑綜合征（White spot syndrome，WSS）和急性肝胰腺壞死綜合征（Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）為主的多種病害給我國對蝦養殖業帶來巨大經濟損失，養殖效益大幅度下降（Flegel et al.，2008；張彬等，2015）。因此，借助現代生物學技術開展對蝦自身生理抗病機制，尤其是先天性免疫防御機理研究，對于推動我國對蝦產業的健康持續發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前的研究已證實，有多個免疫信號通路在對蝦抗病免疫過程中發揮重要功能作用。Zhu和Zhang（2013）研究發現Wnt信號通路參與調節果蠅S2細胞對白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的吞噬作用；Chen等（2013）對WSSV感染前后凡納濱對蝦肝胰腺轉錄組進行比較分析，發現Wnt信號通路相關基因在WSSV感染前后的表達量存在顯著差異。這些研究結果提示Wnt信號通路可能參與對蝦的先天性免疫應答，但具體機理尚需進一步研究驗證。Wnt信號轉導是一條多環節、多作用位點的關鍵信號通路，參與機體生長、發育、代謝等生物學過程，而β-鏈蛋白（β-catenin）是Wnt信號通路的關鍵作用因子（Kestler and Kühl，2008）。Zhang等（2016）的研究結果表明，凡納濱對蝦β-catenin基因被沉默后，其抗WSSV和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的能力均顯著降低，說明β-catenin基因在凡納濱對蝦抗病免疫中可能發揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】CTNNBL1全稱為β-catenin like protein 1，其與β-catenin基因編碼的蛋白結構相似，在功能上與β-catenin基因亦有關聯（Liu et al.，2008），但至今在對蝦類物種中未見該基因的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】克隆凡納濱對蝦CTNNBL1基因（LvCTNNBL1），并進一步分析其組織表達特征及應答WSSV和副溶血弧菌感染的表達模式，旨在明確CTNNBL1基因在凡納濱對蝦抗病過程中的功能作用，為深入探討對蝦抗病免疫機制提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

凡納濱對蝦（8～10 g）購自湛江騰飛實業有限公司，試驗前在水族箱循環系統中暫養7 d，使其適應實驗室養殖環境。攜帶WSSV的凡納濱對蝦及副溶血弧菌由廣東海洋大學營養與飼料實驗室保存提供。RNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit購自美國Clontech公司；PrimerScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、LaTaq酶、pMD20-T載體、DH5α感受態細胞、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）購自日本TaKaRa公司；膠回收試劑盒及DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1. 2 LvCTNNBL1基因cDNA全長克隆及測序

根據前期凡納濱對蝦轉錄組測序結果，獲得LvCTNNBL1基因的EST序列，利用Primer Premier 6.0設計5'RACE和3'RACE特異性引物（表1），所有引物均由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit使用說明反轉錄合成5'RACE和3'RACE所需的cDNA第一鏈模板，按照說明要求進行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，62～57 ℃（每循環遞減0.5 ℃）30 s，72 ℃ 2 min，進行10個循環；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行28個循環；最后72 ℃延伸10 min。RACE擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后與pMD20-T載體連接，轉化至DH5α感受態細胞，陽性克隆經PCR鑒定后送至英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。

1. 3 LvCTNNBL1基因序列生物信息學分析

在NCBI網站上對測序所得結果進行載體序列去除和拼接，然后進行序列比對，利用EditSeq進行開放閱讀框（ORF）預測和氨基酸序列翻譯，并對蛋白質功能結構域等信息進行預測。在NCBI的Protein BLAST數據庫中搜尋具有較高同源性的CTNNBL1蛋白質序列，采用Clustal X進行多序列比對和聚類分析，再以Neighbour-Joining構建系統發育進化樹。

1. 4 LvCTNNBL1基因組織表達分析

凡納濱對蝦暫養1周后，隨機捕撈15尾，每5尾為一組，分別采集血細胞、肝胰腺、鰓、眼柄、肌肉、表皮、胃、腸、后盲囊、神經和心臟等11個組織樣品，置于RNAlater中，室溫下放置1 h或4 ℃過夜后轉移至-80 ℃下保存。樣品總RNA的提取使用RNeasy Mini Kit試劑盒，并采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒合成熒光定量PCR所需的cDNA模板。參照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）說明，對不同組織中LvCTNNBL1基因的表達情況進行定量分析，以延伸因子1α（EF1α，GenBank序列號GU136229）基因作內參基因，所用引物序列見表1；擴增程序：95 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，78 ℃ 5 s，進行40個循環。RT-PCR檢測結果采用2-△△Ct進行分析。

1. 5 LvCTNNBL1基因應答WSSV及副溶血弧菌感染的表達分析

WSSV懸液制備及副溶血弧菌培養鑒定分別參照Melena等（2015）和Balcázar等（2007）的方法。將凡納濱對蝦分為3組，每組80尾，分別注射WSSV懸液（106拷貝/g）、副溶血弧菌菌液（5.5×106 CFU/g）及PBS（對照），注射0、4、8、12、24、48和72 h后采集凡納濱對蝦血細胞，每3尾對蝦為一個混合樣品，每組同一個時間點取3個平行，RT-PCR檢測LvCTNNBL1基因的表達情況，檢測結果經2-△△Ct分析后采用t 檢驗分析組間差異性。

2 結果與分析

2. 1 LvCTNNBL1基因cDNA全長及序列分析結果

LvCTNNBL1基因（GenBank注冊號KX058563）全長cDNA 1906 bp，包含127 bp的5'端非編碼區（5'UTR）、1692 bp的ORF區及87 bp的3'端非編碼區（3'UTR），編碼的蛋白序列含563個氨基酸，預測分子量63.87 ku，等電點5.01（圖1）。SMART分析結果顯示，LvCTNNBL1氨基酸序列含有1個CTNNBL保守結構域（殘基65～ 170）（圖2）。

2. 2 LvCTNNBL1蛋白多重序列比對分析結果

不同物種間的CTNNBL1蛋白保守性較強。經同源性分析，發現LvCTNNBL1蛋白與其他物種CTNNBL1蛋白間的相似度較接近，相似性在72%～77%，其中與大型溞（Daphnia magna）CTNNBL1蛋白的相似性最高，為77%（圖3）。利用MEGA 5.0進行系統發育進化分析，結果顯示，LvCTNNBL1基因與多種無脊椎動物CTNNBL基因聚為一類，與同為節肢動物的大型溞、西方蜜蜂（Apis mellifera）和美洲鱟（Limulus polyphemus）的親緣關系較近（圖4）。

2. 3 LvCTNNBL1基因的組織表達分析結果

采用RT-PCR對不同組織中LvCTNNBL1基因的表達情況進行檢測，結果（圖5）顯示，LvCTNNBL1基因在凡納濱對蝦被檢測的11種組織中均有表達，以在神經、血細胞、心臟、鰓、肝胰腺、胃及腸道中的表達量較高，在表皮、后盲囊、肌肉和眼柄中的表達量較低，其中在腸道中的表達量最高，約是眼柄中的74.32倍。

2. 4 LvCTNNBL1基因應答WSSV感染的表達變化特征

注射感染WSSV后，凡納濱對蝦血細胞中LvCTNNBL1基因的表達量呈先下降后上升趨勢（圖6），在所有檢測時間點，該基因的表達量與對照組間存在顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）差異。在注射感染WSSV后4、8和12 h，凡納濱對蝦血細胞中LvCTNNBL1基因的表達量明顯低于對照組，并于注射后12 h達最低值，僅為對照組的57%；在注射感染WSSV后24、48和72 h，凡納濱對蝦血細胞中LvCTNNBL1基因的表達量極顯著高于對照組，并于注射后72 h達最大值，為對照組的3.04倍。

2. 5 LvCTNNBL1基因應答副溶血弧菌感染的表達變化特征

由圖7可以看出，注射感染副溶血弧菌后4 h，凡納濱對蝦血細胞中LvCTNNBL1基因的表達量較對照組極顯著升高，在注射感染后8 h達最大值，為對照組的1.89倍；在注射感染24 h后，凡納濱對蝦血細胞中LvCTNNBL1基因的表達量又降至與對照組相當的水平，二者間無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

CTNNBL1基因最早在人類細胞凋亡過程中被認識（Jabbour et al.，2003），隨后的研究發現其多態性與人類肥胖及記憶密切相關（Liu et al.，2008；Papassotiropoulos et al.，2013）。本研究從凡納濱對蝦中克隆獲得CTNNBL1基因，并發現其在應答病原感染時的表達量產生顯著變化，提示LvCTNNBL1基因可能參與凡納濱對蝦抗病免疫。LvCTNNBL1基因編碼的蛋白包含一個CTNNBL結構域，與已報道的其他物種CTNNBL1蛋白結構一致（Chandra et al.，2013）。經系統發育進化樹分析，發現CTNNBL1基因被分為脊椎動物和無脊椎動物兩組，凡納濱對蝦與多種無脊椎動物聚集在一個分支上，且與同為節肢動物的大型溞、西方蜜蜂和美洲鱟親緣關系較近，說明在不同動物中CTNNBL1基因進化相對保守。

雖然目前已在多個物種中發現CTNNBL1基因，但絕大多數是通過高通量測序手段進行鑒定，僅掌握相關序列的信息，缺乏深入研究，有關其表達及功能的信息主要集中在人類。與人類相似，LvCTNNBL1基因在凡納濱對蝦中也呈組成型表達，不具有組織特異性，但在不同組織中的表達量存在明顯差異。在人類中，CTNNBL1基因在骨骼肌、胎盤、心臟、腎臟、睪丸及甲狀腺中表達量尤其高（Jabbour et al.，2003），而在凡納濱對蝦中，LvCTNNBL1基因在腸道、胃、肝胰腺、鰓、心臟、血細胞及神經中表達量較高?？梢?，不同物種中CTNNBL1基因的表達模式存在較大差異，可能與物種的特異性相關。此外，作為β-catenin基因的類似物，CTNNBL1基因在凡納濱對蝦中的表達模式與其比較相似，在腸道、鰓、血細胞及神經組織中的表達量均較高（Zhang et al.，2016），提示CTNNBL1基因可能與β-catenin基因具有相似的功能。

在凡納濱對蝦的相關研究中已發現，Wnt信號通路的關鍵因子β-catenin基因被沉默后增強了機體應答WSSV和副溶血弧菌感染的易感性，即β-catenin基因在凡納濱對蝦抗細菌和病毒感染的過程中發揮了積極作用（Chen et al.，2013；Zhang et al.，2016）。本研究結果顯示，在應答WSSV和副溶血弧菌感染過程中，凡納濱對蝦血細胞中LvCTNNBL1基因的表達量均產生顯著變化，提示LvCTNNBL1基因可能也參與了凡納濱對蝦抗病免疫，具體原因可能與β-catenin基因類似有關，但相關作用機制有待深入研究。本研究中，β-catenin基因在凡納濱對蝦感染WSSV后24 h內的表達量顯著低于對照組，可能與對蝦處于WSSV潛伏期有關；而在感染24 h后β-catenin基因表達量極顯著升高，推測WSSV潛伏期已過，β-catenin基因通過正向調控來抵御病毒。相比之下，副溶血弧菌感染后4 h，凡納濱對蝦β-catenin基因表達量極顯著升高，提示細菌感染后β-catenin基因即發揮正向調控作用。

4 結論

本研究結果表明，LvCTNNBL1基因表達量在病毒和細菌感染時發生明顯變化，提示CTNNBL1基因可能參與了凡納濱對蝦的抗病免疫途徑。

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（責任編輯 蘭宗寶）