從江香豬CYP2A19基因單核苷酸多態性的群體遺傳學分析

楊家大 任瓊 吳聲榕

摘要：【目的】評估從江香豬CYP2A19基因的純合度及遺傳變異，為開發從江香豬藥物代謝模型積累基礎資料?！痉椒ā繎肧NaPshot檢測方法對141份從江香豬樣本CYP2A19基因編碼區rs323914689、rs81217981、rs333289891、rs343272409位點及3'端非翻譯區rs338584662和rs321736682位點進行分型分析，并計算從江香豬種群的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數（Ne）、雜合度（He）、多態位點數及多態位點百分比?！窘Y果】除rs333289891位點表現為單態外，其余5個位點均檢測到2種或3種基因型，多態位點百分比為83.33%。χ2檢驗結果顯示，5個多態位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P>0.05）。5個多態位點的Ne介于1.0071～1.3129，He介于0.0071～0.2057?！窘Y論】不同品系豬種由于遺傳背景差異而具有不同的單核苷酸變異，其藥物代謝特性也因此存在差異。從江香豬群體純合度高、遺傳穩定性好、變異程度低，是其作為藥物代謝動物模型的關鍵基礎。

關鍵詞： 從江香豬；CYP2A19基因；多態位點；遺傳學分析

中圖分類號： S828.89 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1209-07

0 引言

【研究意義】從江香豬產于貴州省從江縣，是我國稀有的優良地方微型豬種，其個體矮小，早熟易肥，肉肥而不膩，經白水煮熟后味香、湯清甜、肉質細嫩，是制作高檔肉制品的理想材料。同時，因其體型矮小，解剖學特性、生理學生化學指標與人類相似，基因純合，近交不退化，是較理想的實驗動物模型（楊秀江，2002），在藥物評價中具有廣闊的應用前景。細胞色素氧化酶P450（Cytochrome P450 enzymes，CYP）是一類含亞鐵血紅素的超基因家族酶系，參與機體內生物轉化的I相代謝反應，通過氧化方式可將水溶性差的內、外源性物質轉變為水溶性強的物質，而進入II相代謝反應，在藥物及異源物質的代謝過程中發揮重要作用（張慧鋒等，2005；華梓婷等，2007；商海濤等，2008）。因此，研究從江香豬細胞色素氧化酶的基因純合度及催化特性，對評估其在藥物代謝動物模型中應用的可能性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在人體中，CYP1、CYP2、CYP3這3個家族參與了95%的外源物代謝活動（趙春等，2014）。CYP2A6是CYP2A亞家族的主要酶，存在于成人的肝臟中，其含量占人體CYP總蛋白的4%（張小梅等，2011），代謝的藥物占人體CYP代謝藥物總量的3%（于敏等，2013），特征性反應為香豆素-7'-羥基化反應。CYP2A6還參與黃曲霉素B1、亞硝胺鹽、環境化合物汽油醚及煙草中尼古丁等結構非相關前致癌物的激活（蔣卉和陳一岳，2007）。在豬體內，早在1985年Kaipainen等就檢測到高水平的香豆素-7'-羥基化酶活性。1999年，Skaanild和Friis發現G ttingen小型豬CYP2A活性與Western blotting的蛋白水平相關，且mRNA水平與CYP2A活性呈弱相關，據此推測小型豬CYP2A表達受轉錄水平的調控。此后，Soucek等（2001）對布爾諾白品種G ttingen小型豬肝臟微粒體的研究表明，G ttingen小型豬具有與人體CYP2A6類似的香豆素-7'-羥基化酶活性，以抗人類CYP2A6抗體進行免疫雜交可得到相應的條帶，且測序發現小型豬肝臟CYP2A蛋白N-末端前20個氨基酸與人類CYP2A6的相似度達70%，即小型豬CYP2A具有與人體CYP2A類似的特性。李健等（2006）研究表明，貴州小型香豬肝臟微粒體雖然具有香豆素-7'-羥基化反應（CYP2A）活性，但其活性與人體相應反應的活性存在顯著差異。人體CYP2A選擇性抑制劑——甲氧補骨脂素在低濃度（2.5 μmol/L）下能抑制90%的巴馬香豬香豆素-7'-羥基化反應活性（Li et al.，2006）。此外，有研究資料表明，豬體內存在人體CYP2A6的同源酶（Zamaratskaia et al.，2009；Liu et al.，2011；Rasmussen et al.，2011；Brunius et al.，2012），且根據NCBI數據庫及有關文獻（Matal et al.，2009a，2009b；楊家大等，2011）判定，該酶為CYP2A19?！颈狙芯壳腥朦c】P450基因多態性是造成不同個體藥物代謝差異的重要基礎（張慧鋒等，2005），也是制定個體化用藥方案的重要理論依據（王一珂等，2016），但至今未見有關從江香豬CYP2A19基因多態性的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】應用基于單堿基延伸的SNaPshot檢測方法分析從江香豬CYP2A19基因單核苷酸多態性，評估其基因純合度及遺傳變異，為開發從江香豬藥物代謝模型積累基礎資料。

1 材料與方法

1. 1 從江香豬來源

141頭健康從江香豬分別來自貴州省從江縣宰便、加鳩、加勉、光輝、加榜、剛邊等鄉（鎮），年齡2～3月齡，體重8～11 kg，性別及閹割狀況不限。屠宰后立即剪下一小塊肝臟組織，經生理鹽水沖洗血污后置于液氮中凍存備用。

1. 2 引物設計與合成

根據各SNP位點上、下游250 bp以內的DNA序列，應用Primer Premier 5.0設計PCR引物及延伸反應引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，rs343272409位點檢測的是互補鏈堿基類型。

1. 3 肝臟DNA提取

取5～20 mg肝臟組織樣品，加液氮研磨成粉末，然后按照離心柱型細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司，GK0122）說明進行提取，稀釋至5～10 ng/μL用于PCR。

1. 4 多重PCR及擴增產物純化

反應體系為15.00 μL，包括10×Buffer 1.50 μL，25 mmol/L MgCl2 1.50 μL，10 mmol/L dNTP 0.30 μL，10 μmol/L引物各0.15 μL，基因組DNA 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.30 μL，ddH2O補足至15.00 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；72 ℃延伸3 min。擴增產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進行多重PCR。rs323914689、rs81217981、rs333289891和rs343272409位點在一個反應體系中擴增，rs338584662和rs321736682位點在另一個反應體系中擴增。

純化體系7.0 μL，其中擴增產物3.0 μL、20 U/μL Exonuclease I（Thermo Scientific公司）0.2 μL、1 U/μL FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific公司）0.8 μL、10×Buffer 0.7 μL。純化程序：37 ℃反應15 min，然后80 ℃滅活15 min。

1. 5 多重延伸反應及延伸產物純化

延伸反應體系6.0 μL，包括純化PCR產物2.0 μL、含不同熒光標記ddNTP的SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix（Applied Biosystems公司）1.0 μL、10 μmol/L延伸引物各0.2 μL。反應程序：96 ℃預變性1 min；96 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行30個循環；然后向反應產物中加入FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific公司）0.2 μL，37 ℃處理15 min，再80 ℃滅活15 min。

1. 6 毛細管電泳及基因型判讀

取1.0 μL純化延伸產物，加9.0 μL上樣Formamide deionized（Amresco公司），95 ℃變性3 min后立即冰水浴5 min，在ABI 3730XL型DNA序列檢測儀（Applied Biosystems公司）上進行毛細管電泳約1 h。然后以Peak ScannerTM Software v1.0（Applied Biosystems公司）打開毛細管電泳生成后綴為fsa的文件，再根據延伸產物片段大小、峰圖顏色、突變位置的核苷酸種類等綜合判定各SNP位點在圖譜中的位置及基因型。峰圖中紅、黑、藍、綠波峰分別代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸（T）、胞嘧啶脫氧核苷酸（C）、鳥嘌呤核糖核苷酸（G）和腺嘌呤核糖核苷酸（A）；只有一個峰為純合子，出現2個或2個以上峰則為雜合子。

1. 7 統計分析

采用基因計數法計算種群的基因型頻率，PopGen 32統計等位基因頻率、Hardy-Heinberg平衡的χ2和P、有效等位基因數（Ne）、雜合度（He）、多態位點數及多態位點百分比。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現rs333289891、rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位點的PCR產物片段大小均與預期結果一致，且無非特異性擴增條帶（圖1），說明PCR產物可用作下一步延伸反應的模板。

2. 2 SNP位點的分型峰圖

141份從江香豬樣品CYP2A19基因rs333289891、rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位點的延伸反應產物純化后經ABI 3730XL型DNA序列檢測儀毛細管電泳，并由Peak ScannerTM Software v1.0讀取后，得到各位點的分型圖譜。其中，rs333289891位點僅檢測到1種峰型，對應的基因型為CC（圖2）；rs323914689位點檢測到2種峰型，對應的基因型分別為CC（圖3-A）和CG（圖3-B）；rs343272409位點檢測到2種峰型，對應的基因型分別為AA（圖4-A）和AC（圖4-B）；rs321736682位點檢測到2種峰型，對應的基因型分別為CC（圖5-A）和CT（圖5-B）；rs81217981位點檢測到3種峰型，對應的基因型分別為AA（圖6-A）、AG（圖6-B）和GG（圖6-C）；rs338584662位點檢測到3種峰型，對應的基因型分別為CC（圖7-A）、CG（圖7-B）和GG（圖7-C）。

2. 3 群體遺傳學統計結果

在6個SNP位點中，除rs333289891位點表現為單態外，其余5個位點均檢測到2種或3種基因型，多態位點百分比為83.33%。其中，rs323914689位點的優勢基因型為CC，共138份，基因型頻率為0.9787；rs343272409位點的優勢基因型為AA，共140份，基因型頻率為0.9929；rs321736682位點的優勢基因型為CC，共140份，基因型頻率為0.9929；rs81217981位點的優勢基因型為GG，共107份，基因型頻率為0.7589；rs338584662位點的優勢基因型為GG，共108份，基因型頻率為0.7660。χ2檢驗結果顯示，5個多態位點均處于Hardy- Weinberg平衡狀態（P>0.05）。5個多態位點的Ne介于1.0071～1.3129，He介于0.0071～0.2057。各位點的基因型頻率、等位基因頻率、Ne、He等群體遺傳學指標統計結果見表2。

3 討論

CYP多態性包括酶（表型）多態性和基因多態性。其中，表型多態性可將個體按代謝速度分為強代謝型、弱代謝型、中等代謝型和超強代謝型（于敏等，2013）；而基因多態性是導致個體差異明顯表型多態性的原因（華梓婷等，2007）。根據UCSC Genome Browser和NCBI數據庫信息可知，豬CYP2A19基因登錄號為NM_214417，其DNA序列全長為5387 bp，包含5個外顯子，共有33個已知SNP位點，其中4個位于編碼區，2個位于3'端非翻譯區，其余均位于內含子中。在這2個數據庫中，并未登記有CYP2A19基因SNP位點的等位基因頻率，也未見有關這些等位基因頻率的文獻報道。本研究應用基于單堿基延伸的SNaPshot檢測方法，參考豬CYP2A19基因編碼區及3'端非翻譯區已知的6個SNP位點信息，對從江香豬進行群體遺傳學分析，結果表明，rs333289891位點表現為單態，而數據庫登記該位點為多態位點。由于rs333289891位點突變屬于錯義突變，對應的氨基酸改變為346R→W，即由精氨酸突變為色氨酸，二者的分子大小、極性及電荷性均不一樣。因此，若排除檢測樣本數量的原因，可推測從江香豬CYP2A19基因rs333289891位點具有不同于其他豬種（或品系）的核苷酸，核苷酸組成不同可能導致對CYP2A19底物代謝能力不同，因此從江香豬與其他豬種間的藥物代謝數據不能共享。商海濤等（2008）對原始種群來源于從江香豬的貴州小型豬CYP3A29編碼區基因序列進行克隆測序及比對分析，發現貴州小型豬CYP3A29編碼區存在CYP3A29*1C和CYP3A29*1D共2個SNP位點及1個缺失89 bp并產生移碼的可變剪接。與巴馬香豬及日本學者提交NCBI的AB052260序列相比，CYP3A29*1C位點僅存在于貴州小型豬，在巴馬香豬及AB052260序列中均不存在。據此推測，豬CYP3A29編碼區的單核苷酸變異與其遺傳背景相關，不同品系豬種由于遺傳背景差異而具有不同的單核苷酸變異，不同品系間的藥物代謝特性也因此存在差異，作為藥物代謝模型予以研究時就必須考慮序列變異引起的品系代謝特性差異。

從江香豬CYP2A19基因rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位點雖然均具有多態性，但雜合子頻率非常低，rs323914689、rs343272409 和rs321736682位點均未發現突變型純合子，各多態位點優勢基因型的頻率非常高，2種等位基因的基因頻率差異明顯，說明從江香豬CYP2A19基因純合度高，即驗證了其基因純合的優良特性。5個多態位點的Ne與等位基因實際觀察值間的差值較明顯，表明等位基因在群體中分布不均勻、變異小。此外，從江香豬群體He均低于0.2500，也表明其遺傳變異程度低，遺傳穩定性好。在從江香豬產區多行自繁自養制度，由于長期高度近親繁殖最終形成了高度純合、近親交配不退化、不變異及性成熟早的優良品質（申學林，2005），而這些特性恰好奠定了從江香豬作為藥物代謝動物模型的關鍵基礎。

4 結論

不同品系豬種由于遺傳背景差異而具有不同的單核苷酸變異，其藥物代謝特性也因此存在差異。從江香豬群體純合度高、遺傳穩定性好、變異程度低，是其作為藥物代謝動物模型的關鍵基礎。

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（責任編輯 蘭宗寶）