四指馬鲅消化道黏液細胞的發育規律

謝木嬌 區又君 溫久福 李加兒 周慧 王鵬飛 劉奇奇

摘要：【目的】研究四指馬鲅消化道黏液細胞的發育規律，為指導四指馬鲅育苗過程中適時更換餌料及制定投餌策略、完善育苗工藝和提高育苗成活率提供參考依據?！痉椒ā坷媒M織石蠟切片和阿利新蘭—高碘酸雪夫試劑（AB-PAS）染色，觀察研究1～30日齡四指馬鲅消化道黏液細胞的發生過程?！窘Y果】四指馬鲅的食道最早在5日齡時出現II型黏液細胞；9日齡仔魚食道黏液細胞數量有所增加，胃部已有賁門部、幽門部、胃體部和盲囊部的明顯區域分化，黏膜皺褶豐富，各區域大部分的黏膜表面均有I型黏液細胞分布；15日齡仔魚胃腺區域出現II型黏液細胞，腸道前、中、后段均出現II型黏液細胞，且以圓形為主；17日齡仔魚幽門盲囊區域出現II型黏液細胞；23和30日齡仔魚消化道黏液細胞以II型為主，數量持續增加。四指馬鲅消化道各段黏液細胞密度、大小及分泌能力均隨日齡的增加而增加，且同日齡仔魚消化道中以食道的黏液分泌能力最強?！窘Y論】四指馬鲅消化道黏液細胞的發生和分布特征與仔魚攝食能力日益增強及消化道結構逐漸完善的趨勢相適應。

關鍵詞： 四指馬鲅；消化道；黏液細胞；發生；分布；開口攝食

中圖分類號： S965.329 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1222-06

0 引言

【研究意義】四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）隸屬于鯔形目（Mugiliformes）馬鲅亞目（Polynemoidei）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）（孫典榮和陳錚，2013），廣泛分布于熱帶和溫帶的砂石底海區，如澳大利亞東西海岸、美國夏威夷海域、印度尼西亞海域等（Zischke et al.，2009；Moore et al.，2011；Newman et al.，2011；Ballagh et al.，2012），我國的黃海、渤海、東海和南海也有分布（Wang et al.，2014），目前在我國臺灣、廣東、海南、浙江等地已有人工養殖。黏液細胞隨著機體的生長發育，其成分、形態和分布均會發生明顯變化，可作為檢測消化道功能發育的一項參考依據（謝木嬌等，2015），而消化道的結構發育與功能完善又直接影響仔稚魚對營養物質的吸收利用及其成活率，因此，研究觀察魚類消化道黏液細胞的發育規律對揭示仔稚魚消化道的變化規律及苗種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】黏液細胞分泌的黏液物質包含水解酶、糖蛋白、免疫蛋白、黏多糖等多種活性物質，進而形成協調機體內外環境平衡的黏液屏障（Khojasteh et al.，2009），在潤滑食物、協助消化吸收、抗菌、抗病毒及離子轉運方面發揮作用（Sarasquete et al.，2009）。近年來，已有關于不同魚種消化道黏液細胞發育的研究報道，如波紋唇魚（Cheilinus undulates）（王永波等，2010）、點帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）（李鑫煒等，2012）、哲羅魚（Hucho taimen）（關海紅和尹家勝，2013）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）（張建業等，2014）等。李鑫煒等（2012）研究表明，點帶石斑魚黏液細胞出現的日齡與開口攝食日齡一致，即黏液細胞的存在可能是仔稚魚開口攝食的前提。關海紅和尹家勝（2013）研究發現，哲羅魚黏液細胞發生的部位分別是口咽腔、消化道，黏液細胞開始為囊狀，隨后發育成梨狀，最終發育為杯狀。張建業等（2014）研究發現，泥鰍仔魚3日齡時口腔、食道出現黏液細胞，7日齡時消化道開始出現黏液細胞，且黏液細胞的類型按幼稚型到成熟型的規律發生，并認為3～10日齡是泥鰍仔魚消化道發育的敏感期，20日齡左右消化道功能發育逐漸完善?！颈狙芯壳腥朦c】除本課題組研究報道過四指馬鲅稚魚、幼魚和成魚消化道黏液細胞的組織化學（謝木嬌等，2015）外，至今未見有關四指馬鲅消化道黏液細胞發育的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】針對仔魚在培育過程中呈現生長迅速的特點，從功能細胞角度分析四指馬鲅仔魚消化機能的發育規律，為指導其育苗過程中適時更換餌料及制定投飼策略、完善育苗工藝和提高育苗成活率提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 苗種來源

四指馬鲅受精卵和初孵仔魚由本課題組在南海水產研究所珠海試驗基地培育獲得。仔魚先在室內水泥池培育7 d后轉移到室外土池繼續培育，各階段培育條件：水溫29～32 ℃，鹽度25‰～28‰，溶氧4.80～5.50 mg/L，pH 8.00～8.30，氨氮含量0.20～0.40 mg/L，亞硝酸鹽含量0.005～0.015 mg/L。培育過程中仔魚餌料系列為輪蟲、小球藻、枝角類（2～15日齡）→鹵蟲無節幼體和部分紅蟲（16～30日齡）→粉狀配合飼料和魚肉糜或貝肉糜（31～50日齡）。孵化后第1 d的仔魚為1日齡，以此類推，培育過程中對1～30日齡的魚苗進行連續采樣，每次取樣20尾用10%中性甲醛固定，期間定期更換固定液以延長樣品的保存時間。

1. 2 樣品處理及分析方法

采集樣品中每個日齡段的仔魚取10尾進行常規石蠟切片制作，切片用阿利新蘭—高碘酸雪夫試劑（AB-PAS）進行染色（AB-PAS試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司），具體染色步驟參照試劑盒說明進行操作，在顯微鏡下觀察拍照。根據AB-PAS顯色結果將黏液細胞分為I型、II型、III型和IV型，分別呈紅色（含PAS陽性的中性黏多糖）、藍色（含AB陽性的酸性黏多糖）、紫紅色（主要含PAS陽性的中性黏多糖，同時含少量AB陽性的酸性黏多糖）和藍紫色（主要含AB陽性的酸性黏多糖，同時含少量PAS陽性的中性黏多糖）。同時參照王永波等（2010）的方法統計消化道各段各類型黏液細胞的密度、細胞長短徑及消化道各段的分泌能力[單位面積黏液細胞密度與細胞表面積（π×長徑×短徑/4）的乘積]，其中細胞密度統計樣本為消化道各段取3張相鄰切片隨機選10個視野，分別測量每個視野中1 mm2范圍內各類型黏液細胞的總數，同時測量黏液細胞（n=10）的長徑和短徑。試驗數據采用SPSS 19.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結果與分析

2. 1 黏液細胞的發生過程

1～4日齡四指馬鲅仔魚消化道由簡單的直線管發育到基本與外界連通狀態，包括食道、胃部和腸道基礎的分化，但黏膜上皮間未見有黏液細胞分布。5日齡仔魚食道形成1～2個黏膜皺褶，上皮基底層和中間層出現少量II型黏液細胞，均為圓形且被染成深藍色的細胞，胞質均勻（圖1-1）；胃腸黏膜皺褶增多變扁平，其黏膜邊緣呈淡藍色，但仍未見有黏液細胞分布。9日齡仔魚食道黏液細胞仍是圓形的II型黏液細胞（圖1-2）；胃部呈Y形，賁門部、幽門部、胃體部和盲囊部呈明顯的區域分化，黏膜皺褶豐富，各區域大部分的黏膜表面被染成淺紅色，為含中性黏多糖的I型黏液細胞；腸道仍無前、中、后腸的分化，上皮間未見黏液細胞。15日齡仔魚胃部以I型黏液細胞為主，但在有胃腺分布的區域（除幽門部外）分布有藍色的II型黏液細胞（圖1-3），腸道前、中、后段也出現藍色的II型黏液細胞，且以圓形為主（圖1-4和圖1-5）。17日齡仔魚食道上皮分布有大量的II型黏液細胞，復層上皮因黏液細胞密集而被染成深藍色，部分細胞染色較淺呈空泡狀（圖1-6），胃部胃腺區域的II型黏液細胞數量增多，黏膜表層檢測出藍色（II型）和紅色（I型）交替的黏液細胞線，幽門盲囊區域形成4～6個管腔，均可檢測出II型黏液細胞（圖1-7）。23和30日齡仔魚消化道黏液細胞類型維持不變，以II型為主，但數量持續增加（圖1-8～圖1-15）。

2. 2 消化道各段黏液細胞密度的變化

由表1可以看出，四指馬鲅消化道各段的黏液細胞密度隨日齡增加呈顯著的增加趨勢（P<0.05）。5日齡仔魚食道開始分化出黏液細胞，密度為52.09±1.01個/mm2，發育至9、15、17、23、30日齡時分別為161.45±0.90、259.98±12.34、216.65±12.82、471.62±10.38和1489.49±8.45個/mm2；幽門盲囊黏液細胞發生時（17日齡）的密度為200.65±8.30個/mm2，23日齡時增加至590.38±2.91個/mm2，30日齡時達687.45±3.81個/mm2；腸道從15日齡起出現黏液細胞，密度為239.98±9.31個/mm2，至30日齡時達462.72±10.29個/mm2。

2. 3 消化道黏液細胞大小變化及各段的分泌能力

四指馬鲅消化道各段黏液細胞的大小也隨日齡的增加而增大，其中以食道黏液細胞大小增長最明顯（表2）。黏液細胞大小與其密度的乘積可用于衡量消化道各段的黏液分泌能力，由表3可知，四指馬鲅消化道各段的黏液分泌能力亦隨日齡的增加而不斷提高，同日齡仔魚消化道中以食道的黏液分泌能力最強。

3 討論

3. 1 四指馬鲅消化道黏液細胞發生的規律

黏液細胞的成分差異可反映魚類發育階段（Leknes，2010，2011；辛儉等，2013）。四指馬鲅仔魚消化道最早（5日齡）在食道黏膜出現II型黏液細胞，而胃部最先（9日齡）出現I型黏液細胞，隨著日齡增加才逐漸出現II型黏液細胞，幽門盲囊在17日齡時可檢測到II型黏液細胞，腸道最先（15日齡）發育的是II型黏液細胞，同時含有少量I型黏液細胞，且消化道各段在30日齡時均未見III型和IV型黏液細胞。四指馬鲅的I型和II型黏液細胞均為幼稚型黏液細胞，僅含有單一種類的黏多糖，與點帶石斑魚（李鑫煒等，2012）、泥鰍（張建業等，2014）的消化道黏液細胞發育特點相似，表明在魚類的早期發育過程中，黏液細胞與消化道自身發育有緊密聯系，黏液細胞從幼稚型向成熟型轉變體現了消化道結構從發生到成熟的變化過程。本研究發現，四指馬鲅仔魚在不同日齡中消化道各段所含的黏液細胞總密度各不相同，分泌能力也存在日齡和部位的差異，即反映消化道各段在執行消化吸收功能的地位，其中以食道在不同日齡中的黏液分泌能力最強，表明食道在協助食物消化吸收過程中發揮了重要作用。大多數硬骨海水魚類食道被覆復層的黏膜上皮并分布有大量黏液細胞（Díaz et al.，2008），由其分泌的黏液物質在保護黏膜上皮免受機械損傷和細菌入侵及離子吸收等方面發揮作用（Díaz et al.，2006）。此外，四指馬鲅為肉食性魚類，食道很短，借助其發達的肌肉層和黏膜層實現攝入足量食物進行機械消化的目的，而豐富的黏液物質有利于潤滑食物使其快速往胃部推送。

3. 2 四指馬鲅消化道早期發育中黏液細胞的功能

四指馬鲅早期發育的消化道黏液細胞發育順序為II型→I型，其中II型黏液細胞在17日齡后整個消化道均有分布，尤其在食道和腸道分布較多，其分泌的酸性黏液物質（主要含有酸性糖蛋白復合物）與含中性糖蛋白的黏液物質不同，可增加表面黏液的黏性（Kumari et al.，2009），以此潤滑食物（魚類攝入的一些軟體動物、甲殼類小型魚類和昆蟲等）并保護黏膜表面，還起到協助機體對食物的轉運和吞咽作用，而且腸道是吸收營養物質及清除有害微生物的場所，富含的II型黏液細胞可能與刺激黏膜免疫發生有關（Khojasteh et al.，2009）。本研究中，5日齡四指馬鲅仔魚食道開始出現II型黏液細胞，隨著日齡的增加，消化道II型黏液細胞數量呈明顯的增加趨勢，但未見其他類型（III型、IV型）黏液細胞，故推測II型黏液細胞在仔魚早期發育過程中維持機體正常消化功能和形成一定黏膜免疫能力方面占主導地位。四指馬鲅仔魚在3日齡時開口，體內消化道與外界連通，消化道具備簡單的攝食和消化能力，但尚未分化完備的消化器官，隨著營養方式轉變為外源性營養，攝食同時也增加了有害微生物入侵的機會，分泌酸性黏液物質的II型黏液細胞在一定程度上能協助食物消化吸收及提高機體抵御不良環境的能力；四指馬鲅腸道從15日齡開始分化出II型黏液細胞和少量I型黏液細胞，其中I型黏液細胞分泌的中性黏多糖常與堿性磷酸酶共存，有利于乳化食物，且中性黏液物質可作為酶解食物過程中的必需輔助因子（Carrassón et al.，2006），表現為吸收功能與防御能力相協調。四指馬鲅從9日齡起胃部黏膜開始出現I型黏液細胞，且數量隨日齡的增加而增加，營造出中性黏液環境以利于食物的快速消化，與平鯛（Rhabdosargus sarba）（勾效偉等，2008）、黃鰭鯛（Sparus latus）（王永翠等，2012）、黃斑籃子魚（Siganus oramin）（區又君等，2013）的研究結果相似。

3. 3 研究黏液細胞發育對育苗的指導意義

在仔魚培育過程中，選擇適口餌料與及時更換餌料并制定投餌策略是提高育苗成活率的關鍵措施之一。已有研究發現，黏液細胞的出現與仔稚魚開口日齡具有一致性，且黏液細胞的存在可能是仔魚開口的前提（李鑫煒等，2012）。張建業等（2014）研究發現，泥鰍在開口時（3日齡）口咽腔即出現酸性黏液細胞，且其分泌的黏液物質在仔魚進入外源性營養期間對食物的消化起主要作用。但本研究發現，四指馬鲅仔魚的開口日齡（3日齡）與黏液細胞發生日齡（5日齡）并不一致，可能與種屬特異性、培育環境及仔魚營養方式轉變有關，仔魚開口前由卵黃囊提供營養物質，為內源性營養期，開口攝食后由于消化道發育尚不完善，并未直接進入完全外源營養階段，而是經歷短暫的混合營養期，此期間（3～5日齡）尚未分化出黏液細胞，表明此階段仔魚體內執行消化功能的并非黏液細胞分泌的黏液物質。至5日齡時卵黃囊吸收完畢，消化道結構得到發育的同時出現黏液細胞，消化機能進一步提高，使得仔魚具備獨立攝食、消化和吸收的能力，進入完全外源性營養期成為可能。值得注意的是，雖然仔魚在5日齡時出現黏液細胞，但分泌黏液物質單一且量不多，消化吸收能力較差且應對不良環境的能力較低，極易感染疾病，因此，此階段除了要保證餌料充足外，還應加強仔魚培育的日常管理。

4 結論

四指馬鲅消化道內黏液細胞按食道、胃部、腸道、幽門盲囊的次序發生，其類型從II型→I型的順序出現，且不同部位黏液細胞密度、大小及分泌能力均隨日齡的增加而增加，黏液細胞這種發生和分布的特征與仔魚攝食能力日益增強及消化道結構逐漸完善的趨勢相適應。

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（責任編輯 蘭宗寶）