餌料中添加鎘對羅非魚組織形態的影響

羅永巨 鐘歡 周毅 單丹 郭忠寶 黃一帆 鄒源 徐跑

摘要：【目的】探討攝入鎘在羅非魚中的累積效應及其對腸道、腎臟和肝臟組織的影響，為羅非魚及其他水產品種的養殖及質量安全控制提供理論依據?！痉椒ā吭诹_非魚餌料中分別添加0、50、100和200 mg/kg的氯化鎘，按魚體重3.0%～3.5%的量投喂2月齡健康吉富羅非魚，飼養60 d后測定羅非魚腸道、腎臟和肝臟組織中的鎘含量，并取樣制作石蠟切片觀察組織形態結構的變化?！窘Y果】至試驗結束時，各處理組間的羅非魚全長、體長、體高等指標無顯著差異（P>0.05），但其腸道、腎臟和肝臟組織中鎘含量均隨食物相鎘添加量的增加而升高，且存在明顯的劑量—效應關系。投喂含鎘餌料可引起羅非魚腸道、腎臟和肝臟組織形態結構發生病理變化，具體表現為腸絨毛排列紊亂、上皮細胞出現明顯的空泡變性；腎小管排列結構紊亂程度加重、腎小球出現輕度萎縮甚至壞死；肝竇增寬、結構紊亂，少數肝細胞核濃縮變小甚至溶解，肝細胞界限模糊不清?！窘Y論】食物相鎘對羅非魚生長的影響是通過富集于腸道、肝臟和腎臟等組織中，并引起這些組織細胞凋亡及破壞關鍵組織形態結構來實現。

關鍵詞： 羅非魚；鎘；富集；腸道；腎臟；肝臟；組織形態

中圖分類號： S965.125 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1228-06

0 引言

【研究意義】隨著我國工業的快速發展，環境中重金屬污染問題日益嚴重。重金屬毒性較大，且能夠長期富集于生物體內，已成為最嚴重的環境污染物之一（任繼平等，2003），其中鎘（Cd）由于毒性強、環境持久性長及易被生物體累積等特點（沈雪婷等，2014；邢丹等，2016）而受到廣泛關注。在聯合國環境規劃署提出的12種具有全球性意義的危險化學物質中，鎘被列為首位（成喜雨等，2015）。因此，研究鎘元素在生物體內的遷移及富集情況對評估鎘污染風險具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，農業和工業活動排放的三廢是環境污染物鎘的主要來源（任繼平等，2003），并通過不同途徑（表面吸附、水相及食物相等）富集于植物或動物體內，進入食物鏈，最終影響人類健康（黃秋嬋等，2007）。魚類是水生動物的重要成員，對水環境中的鎘污染物非常敏感。當水體中的鎘濃度過高時，可造成魚類生理活動紊亂、行為異常及組織細胞病變等（尚曉迪和何志強，2009）。另外，鎘對魚類的內分泌系統、免疫系統及生殖系統均能造成不良影響（蘇傳福，2005）。張玉平等（2008）研究表明，高濃度和長時間的鎘脅迫能抑制大彈涂魚肝臟超氧化物歧化酶活性，致使其機體出現中毒癥狀。胡蓉等（2011）研究表明，鯽魚紅細胞對鎘的最大耐受力為1.5 mg/L脅迫24 h或0.4 mg/L脅迫48 h?？梢?，研究重金屬鎘對魚類組織形態的影響，不僅能闡明鎘對魚類的毒理學效應，還可為評估鎘污染風險提供參考依據。對水生生物來說，水相及食物相是重金屬累積的重要途徑，傳統的暴露試驗只考慮水相而忽略了食物相的貢獻，但近年來的研究表明，食物相可能是許多水生生物體內重金屬累積的主要途徑（王文雄和潘進芬，2004）?！颈狙芯壳腥朦c】羅非魚是世界性養殖魚類，是聯合國糧農組織（FAO）向全世界推廣養殖的主要對象，同時被我國農業部定為優先發展的淡水養殖優勢品種。我國羅非魚產量目前穩居世界第一，占全世界總產量的40%以上，但至今有關鎘對羅非魚組織形態影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過測定羅非魚組織器官中的鎘含量，探討攝入鎘在羅非魚中的累積效應及其對腸道、腎臟和肝臟組織的影響，以期為羅非魚及其他水產品種的養殖及質量安全控制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2014年6月從廣西水產科學研究院羅非魚遺傳育種中心挑選2月齡的健康吉富羅非魚（體重58.80±13.84 g），在1500 L的聚乙烯塑料桶中暫養15 d，以適應實驗室環境?；A餌料配方：20%魚粉、25%豆粉、20%玉米粉、30%次粉、3%維生素和礦物質預混料、0.5%羧甲基纖維素。維生素和礦物質預混料配方：維生素A 22.0萬U/kg、維生素D3 11.0萬U/kg、維生素E 1500 U/kg、維生素K 0.8 g/kg、維生素B1 1.1 g/kg、維生素B2 2.2 g/kg、維生素B6 2.0 g/kg、維生素H 15.0 mg/kg、維生素B12 4.0 mg/kg、維生素C 3.0 g/kg、鐵元素160.0 mg/kg、鎂元素344.0 mg/kg、銅元素21.6 mg/kg、鋅元素21.6 mg/kg、硒元素25.0 mg/kg和鈷元素2.38 mg/kg。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設計 試驗共配制3個鎘濃度梯度餌料，即在基礎餌料中分別添加50、100和200 mg/kg的氯化鎘；對照組餌料未添加氯化鎘。用噴壺將不同濃度的鎘溶液均勻噴灑在基礎餌料上，直至噴完，然后置于薄膜上自然風干。試驗前測得對照組和3個試驗組（I～III）餌料中的鎘含量分別為1.43、39.88、78.63和161.15 mg/kg。

1. 2. 2 飼養管理 每處理組110尾羅非魚，每組3個重復。整個試驗周期60 d，每天投喂3次餌料，投喂量為魚體重的3.0%～3.5%。每次投喂結束后，及時用吸污工具把殘余餌料及糞便等清理干凈；在飼養期間，每2 d換水1次，養殖用水為曝氣后的自來水。養殖水溫25.0～27.0 ℃、pH 7.1～7.6、溶氧量6.2～8.9 mg/L、氨氮含量1.41±0.21 mg/L、亞硝酸鹽氮0.065±0.016 mg/L、總硬度（以CaCO3計）90.03±2.18 mg/L。

1. 2. 3 生長指標測定 所有羅非魚在試驗結束時均測量全長、體長和體高，并統計各處理組羅非魚的存活率和肝體比（肝臟重量/體重）。

1. 2. 4 組織中鎘含量測定 試驗結束后，分別對每處理組羅非魚（6尾雌魚、6尾雄魚）的腸道、腎臟和肝臟進行取材，然后以ICP-MS進行鎘含量測定。具體步驟：稱取1.0 mg樣本置于塑料離心管中，加入1.0 mL硝酸，過夜硝化浸泡；待樣本溶解后轉入刻度石英管中，并用水沖洗干凈，重新加入1.0 mL硝酸；放入石墨消解儀中低溫消解至溶液清亮，取出冷卻后加雙蒸餾水定容至10.0 mL；搖勻，靜置過夜，采用電感耦合等離子體質譜儀對樣品中的鎘含量進行測定。

1. 2. 5 組織學切片及觀察 取羅非魚的腸道、腎臟和肝臟組織，經Bouins液固定24 h后放入70%酒精中。梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，萊卡切片機切片（厚度7 μm）。將干燥后的切片經二甲苯脫蠟后梯度復水，再進行蘇木精—伊紅染色、二甲苯透明、樹脂封片。組織石蠟切片采用萊卡光學顯微鏡觀察并用顯微照相系統拍照。

2 結果與分析

2. 1 食物相鎘對羅非魚生長的影響

整個試驗過程中，僅試驗組II和試驗組III出現羅非魚死亡現象，死亡率均為1.8%。投喂含鎘餌料對羅非魚生長的影響不明顯，飼養60 d后各處理組間的羅非魚全長、體長、體高等指標（表1）無顯著差異（P>0.05，下同），但試驗組I雌、雄性羅非魚的肝體比顯著高于其他處理組（P<0.05，下同），分別為（1.93±0.56）%和（1.77±0.38）%。

2. 2 鎘在羅非魚各組織中的富集情況

由圖1可以看出，試驗組II和試驗組III羅非魚腸道組織中的鎘含量較對照組有顯著升高，試驗組I羅非魚腸道組織中的鎘含量也高于對照組，但差異不顯著。投喂含鎘餌料60 d后，羅非魚腎臟組織中的鎘含量均顯著高于對照組，其中以試驗組III羅非魚腎臟組織中的鎘含量最高，達91.24±30.34 μg/g。鎘在肝臟組織中的富集情況與其在腎臟組織中的富集情況一致，均存在明顯的劑量—效應關系，3個試驗組的羅非魚肝臟組織中的鎘含量均顯著高于對照組，也是以試驗組III羅非魚肝臟組織中的鎘含量最高，達58.90±17.00 μg/g。

2. 3 鎘對羅非魚組織形態結構的影響

投喂60 d含鎘餌料后，羅非魚的腸絨毛排列紊亂，尤其是試驗組II和試驗組III更明顯，上皮細胞出現明顯的空泡變性（圖2）。隨著鎘添加量的增加，羅非魚的腎小管排列結構紊亂程度加重，腎小球出現輕度萎縮，甚至有壞死現象（圖3）。羅非魚肝臟組織形態結構受投喂含鎘餌料的影響較明顯，隨著鎘添加量的增加，亦出現肝竇增寬、結構紊亂的病變；此外，有少數肝細胞核濃縮變小，甚至溶解，肝細胞界限模糊不清（圖4）。

3 討論

鎘是動物機體生長發育過程中的非必需元素，長期在機體內殘留對其正常生理活動會有明顯影響。丁磊等（2005）研究了不同鎘濃度添加餌料對鯽魚增重率的影響，結果顯示，低濃度組（3、18和108 mg/kg）的鯽魚增重率明顯上升，而高濃度組（648 mg/kg）的增重率明顯下降。在不同物種中，鎘對其生長發育的影響作用也有所不同，即使是同一物種，不同鎘濃度對其生長發育造成的影響也存在明顯差異。本研究結果表明，食物相鎘暴露對羅非魚生長無明顯影響，但試驗組I（39.88 mg/kg）羅非魚的肝體比呈顯著上升，提示投喂含鎘餌料后有可能對肝臟產生毒理作用。肝臟是鎘的主要富集部位，因此鎘暴露對肝臟損傷較大，即羅非魚肝臟在39.88 mg/kg鎘含量組暴露60 d后有明顯的損傷癥狀；而在高濃度組（78.63和161.15 mg/kg）未出現肝臟腫大，可能與內分泌、抗氧化、免疫等系統的反饋抑制調節機制有關，但具體原因有待進一步探究。

重金屬主要通過兩種方式進入魚體：第一，水體中的重金屬可通過鰓呼吸進入血液循環系統，最終被轉移到其他組織；第二，餌料中的重金屬由腸道吸收，最終轉移到其他組織。魚鰓及腸道是兩個主要的重金屬吸收部位。由于水體中的重金屬通常與急性毒性有關，因此水中重金屬通過鰓吸收的研究已廣泛開展。近年來，食物相重金屬吸收也日益受到重視，并認為食物中的重金屬是其富集于魚體內的主要途徑（Castro-González and Méndez-Armenta，2008）。本研究結果表明，食物相鎘暴露之后，羅非魚的腸道、肝臟、腎臟組織中均有鎘累積，積累量排序為腎臟>腸道>肝臟，由此可看出鎘在魚體組織間的流動性。腸道是消化食物的直接組織，即餌料中鎘最先殘留在腸道組織。腎臟和肝臟組織作為重要的解毒和代謝器官，鎘的存貯對其行使功能有重大影響。因此，在后續研究中應探析影響不同組織富集鎘的關鍵因子，進而揭示鎘對這些組織器官的毒害作用。

本研究結果表明，在鎘暴露后，羅非魚腸絨毛排列不規則，杯狀細胞數量增加，且出現水腫現象。小腸絨毛是腸道內部行使消化吸收功能的重要場所，其長度和隱窩性狀是影響營養物質消化吸收的關鍵因素，鎘可引起小腸絨毛受損，進而導致腸道消化吸收能力下降（Berntssen et al.，2001）。腎臟是重要的排泄、分泌、代謝和免疫器官，其損傷可引發多種并發癥，導致機體生理活動失調。在哺乳動物中，鎘中毒會損害腎臟，而腎臟損傷可進一步導致睪丸損傷、心臟病死亡率增加及高血壓等并發癥（Saboli et al.，2010）。在硬骨魚中，鎘暴露可導致其腎小管出現粉色顆粒狀，并出現細胞核碎片化等其他退行性特征（Annabiet al.，2011）。鎘對腎臟組織形態結構的影響主要集中在對腎小管的破壞，且鎘富集量與損傷程度呈正相關。本研究結果表明，在鎘損傷的羅非魚中，腎小管排列結構紊亂程度加重，腎小管出現上皮細胞變性、壞死現象。

急性暴露導致鎘積累主要在肝臟組織（Thophon et al.，2003），因此肝臟是受鎘急性中毒的靶器官。急性鎘中毒的肝臟組織形態結構主要表現為肝細胞腫脹、脂肪累積增多及大規模肝細胞壞死。此外，鎘中毒可導致肝臟線粒體腫脹及粗面內質網囊泡破壞（Li et al.，2003）。本研究結果表明，在鎘暴露后肝臟細胞出現空泡變性、部分肝細胞核濃縮變小甚至溶解，同時出現肝竇增寬、結構紊亂等現象，充分證明了鎘對肝臟的毒性作用。雖然鎘對羅非魚肝體比的影響并不明顯，但肝臟細胞水平已明顯被破壞，其差異原因有待進一步研究。

4 結論

食物相鎘對羅非魚生長的影響是通過富集于腸道、肝臟和腎臟等組織中，并引起這些組織細胞凋亡及破壞關鍵組織形態結構來實現。

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（責任編輯 蘭宗寶）