利用新型熒光銀納米團簇實現谷胱甘肽的快速精確檢測

黃科翰、秦翠芳、曹瀟丹、楊太群、陳瑜婷、張三軍、潘海峰、徐建華

精密光譜科學與技術國家重點實驗室、華東師范大學、上海 200062

利用新型熒光銀納米團簇實現谷胱甘肽的快速精確檢測

黃科翰、秦翠芳、曹瀟丹、楊太群、陳瑜婷、張三軍、潘海峰*、徐建華

精密光譜科學與技術國家重點實驗室、華東師范大學、上海 200062

谷胱甘肽(GSH) 是一種含有巰基的三肽分子、參與許多細胞內生化過程、具有抗氧化和整合解毒功能、在生物體內以及醫學、食品等領域有著極為重要的作用。GSH參與細胞內、體液中的許多重要生化反應、其在人體內含量的變化、相應地提示了人體的健康問題。目前對GSH的檢測手段有表面增強拉曼光譜(SERS)、電化學分析、高效液相色譜(HPLC)等、這些方法大都操作復雜、耗時較長或者需要昂貴的儀器。利用一種新型熒光銀納米團簇(Ag NCs)作為探針、通過同時分析銀納米團簇的熒光強度變化以及熒光峰位置移動實現了GSH的高精度快速檢測。在檢測過程中、GSH分子與熒光探針發生化學反應、改變了熒光探針的光化學特性、其熒光強度因發生猝滅而減弱、且其熒光峰位置因配體的改變也發生移動。通過對照組實驗、我們進一步證明了所發展的檢測方法對GSH目標具有很好的特異性，綜合考察熒光強度和波長的變化數據可以很好地區分GSH以及其他結構類似的分子、同時探針對于多種鹽離子及氨基酸等不敏感、能夠很好地保證檢測的準確性。我們報導的熒光探針合成步驟簡單、過程綠色環保、GSH檢測的響應速度快、光譜波動較小、相對誤差小。進一步的研究有望實現細胞內的GSH高精度檢測及成像。

熒光光譜分析; 谷胱甘肽檢測; 熒光探針; 銀納米團簇

引 言

谷胱甘肽(GSH)是一種重要的三肽、它由L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸三種常見氨基酸縮合而成、分布于人和動物的組織液和體液中[1]。尤其重要的是、體內谷胱甘肽含量水平異常、可提示身體患有疾病、例如HIV、帕金森綜合征、肝損傷、炎癥等都會引發體內谷胱甘肽含量的異常[2]。因此快速、高效、準確的檢測谷胱甘肽、在對探明GSH在生理、病理上的功能以及揭示與之相關的含硫蛋白的生理、病理過程、疾病診斷領域的潛在應用上具有重大的意義。近年來、許多檢測手段紛紛出現、比如MnO2量子點熒光探測[3]、SERS[4]、電化學分析、高效液相色譜HPLC[5]、毛細管電泳[6]等。

熒光探針是一種新型的GSH檢測手段、具有靈敏、準確、高選擇性以及合成技術相對簡單優點[7-8]。量子點(QDs)、金銀納米顆粒、納米粒子上轉換(UCNPs) 等都已經作為熒光探針被成功地用于GSH的檢測[3]、這些方法通常都是基于熒光探針的熒光峰強度的變化而達到檢測目標的目的。熒光峰的強度變化通常不易觀察、檢測相對誤差大、同時也需要昂貴精密的儀器、復雜的技術操作、很難達到快速檢測的要求。

尺寸極小(<2 nm)的貴金屬納米團簇(NCs)、通常由幾個到幾百個金屬原子組成、具有介于單個原子和納米晶體(>2 nm)之間的物理化學特性[9-10]。由于其受到強的尺寸限制、納米團簇(NCs)具有分離的、大小可調的電子能級、并具有類分子特性、例如量子化充電[10-11]。最新的研究已表明、發光的金(Au)銀(Ag)團簇(NCs)在生物成像與生物探測的光學探針領域極具前景。與Au NCs相比、Ag NCs具有較低的生物毒性、較高的量子產率[12]。

本文報道一種基于熒光峰波長移動與熒光強度共同作用的新型熒光銀納米團簇快速探測谷胱甘肽的方法、比傳統的依靠熒光峰強度變化探測的方法可以實現更精確、更快速的GSH檢測。作為熒光探針的銀納米團簇利用聚(乙烯基甲醚-alt-馬來酸)(PMVEM)作為模板劑制備、合成步驟簡單制備方便。由于Ag NCs具有很好的生物兼容性、因此本方法還有望應用于細胞內GSH探測或成像、這為熒光探針方法檢測GSH拓展了新思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

還原型谷胱甘肽(L-GSH、≥98.0%)、聚(乙烯基甲醚-alt-馬來酸)(PMVEM、Mw ～216000)、硝酸銀(AgNO3、>99%)、巰基琥珀酸(MSA、>97%)購自Sigma-Aldrich； 氫氧化鈉(NaOH)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸鈉(NaNO3)、纈氨酸(Val)、組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)均為分析純、購于國藥集團化學試劑有限公司； 所有試劑均未經過進一步純化。實驗所用水均為18.2 MΩ去離子水。

暗箱式紫外分析儀(ZF-20D、上海越眾) 、穩態熒光光譜儀(FluoroMax-4、Horiba)、紫外-可見分光光度計(TU1901、北京普析通用)。

1.2 光催化合成原始熒光銀納米團簇(PMVEM-Ag NCs)

合成Ag NCs的方法如參考文獻[13]所述。簡要的過程如下、稱取204 mg AgNO3加入到10 mL去離子水中攪拌溶解； 417.92 mg PMVEM加入到15 mL去離子水中攪拌溶解、同時加入～2 mL 2 mol·L-1的NaOH溶液使溶液pH 9。將配置成的PMVEM溶液倒入AgNO3溶液中并遮光不斷攪拌10 min。將混合液在365 nm紫外燈下照射30 min。制得原始PMVEM-Ag NCs。

1.3 谷胱甘肽(GSH)檢測

取合成的PMVEM-Ag NCs溶液0.6 mL、加入到2.4 mL去離子水中、混勻、再加入0.6 mL不同濃度的GSH溶液混合均勻、靜置10 分鐘。對照組與此類似、加入不同的氨基酸與鹽溶液。

2 結果和討論

2.1 GSH檢測

AgNO3與PMVEM在365 nm紫外光照射下一步光還原形成PMVEM-Ag NCs。合成的Ag NCs在350 nm處有一個吸收峰、這是由PMVEM帶有的羧基(—COOH) 產生的、團簇的熒光激發峰在355 nm、與羧基(—COOH) 吸收峰十分接近、團簇熒光是由羧基吸收紫外線與Ag核產生的配體—金屬(L—M) 電荷轉移形成的輻射躍遷所致[13]、PMVEM中羧基(—COOH)與Ag的L—M效應產生的發光峰位于約530 nm處、我們測得其量子產率約為1%左右。

圖1 (a)PMVEM-Ag NCs在加入不同摩爾百分比[GSH/Ag]后的熒光光譜； (b) PMVEM-Ag NCs水溶液中的熒光強度和峰值位置隨不同摩爾百分比[GSH/Ag]的變化； 激發波長為355 nm

Fig.1 (a)Fluorescent spectra of PMVEM-Ag NCs at different percentages of molar concentration ratio[GSH/Ag]; (b) the photoluminescence intensity (PL) of PMVEM-Ag NCs and fluorescence peak position change with different [GSH/Ag] in aqueous solution. The excitation wavelength was fixed at 355 nm

固定溶液中PMVEM-Ag NCs的濃度、并逐漸增加GSH的濃度、圖1(a)表明隨著摩爾濃度比值[GSH/Ag]的百分數增加、PMVEM-Ag NCs的熒光峰位置逐漸藍移、同時熒光強度也不斷減弱。圖1(b)顯示隨著[GSH/Ag]的摩爾比百分比從0～70 、團簇熒光峰從530 nm藍移到447 nm、同時熒光峰強度也逐漸猝滅、強度降低到原始Ag NCs強度的3.88%。團簇熒光峰位置及熒光峰值強度與[GSH/Ag]摩爾濃度比值的關系大致滿足關系式

λPL=Ae-R/b+k

IPL=Ce-R/d+l

其中:λPL表示納米團簇的熒光峰波長、IPL表示納米團簇的熒光峰值強度、R表示GSH與Ag的摩爾百分比、A、b、k、C、d、l為常數。

至此、通過同時檢測銀納米團簇的熒光峰波長移動和強度變化、我們就可以得知GSH與AgNCs的摩爾百分比、在已知PMVEM-AgNCs濃度的條件下、實現GSH的有效檢測。探針探測GSH的檢測限為0.1mmol·L-1級別。進一步稀釋探針溶液的濃度、提高熒光探測器的靈敏度、可以將檢測限降至更低的濃度。

2.2 檢測機理

熒光峰的移動是由于GSH上帶有的巰基(—SH)刻蝕銀PMVEM-AgNCs形成新的團簇所致。由于GSH上巰基(—SH)與Ag結合能力強過PMVEM上羧基(—COOH)與Ag的結合能力、團簇上的PMVEM被GSH取代、原始PMVEM-AgNCs結構被破壞、并重新與GSH形成新的團簇(GSH-AgNCs)、這些團簇也能發出熒光、但其發光波長與原始的PMVEM-AgNCs不同。GSH與Ag形成的新納米團簇中、由于巰基(—SH)與Ag具有較強的絡合能力、使GSH分子能與Ag絡合在一起、GSH上羧基、N原子同時也與Ag靠近并產生相互作用。GSH中羧基(—COOH)與Ag的絡合發出的熒光與PMVEM中羧基(—COOH)絡合發出的熒光一致、具有增強熒光的作用；N原子與Ag絡合產生了新的輻射性LUMO-HUMO能級、產生的熒光位置大約在420nm左右[13]。整體熒光減弱是由于新形成的熒光團簇結構很少、且過量巰基(—SH)同樣會過度刻蝕新形成的發光團簇。

圖2 (a) PMVEM-Ag NCs在加入不同摩爾百分比[MSA/Ag]后的熒光光譜； (b) PMVEM-Ag NCs水溶液中加入不同摩爾百分比的GSH(紅線)和MSA(藍線)后的熒光光譜； 對照組為原始的PMVEM-Ag NCs; 激發波長為355 nm

Fig.2 (a) Fluorescent spectra of PMVEM-Ag NCs with different percentage of molar concentration ratio[MSA/Ag]; (b) fluorescent spectra of PMVEM-Ag NCs with different concentration of GSH (red curve) and MSA (blue curve) in aqueous solution; compared with the fluorescent spectra of original PMVEM-Ag NCs. The excitation wavelength was fixed at 355 nm

深入研究探針的機理對于改進探針的性能以及開發新型的探針等都具有重要的意義。發光金屬納米團簇的發光機理曾被認為是金屬核的量子局限效應(quantum confinement)、不同的發光波長是由于金屬核大小差異引起的。所以對于基于金屬納米團簇探針的機理解釋中、也采用量子局限效應的概念。例如、Mrudula[14]解釋是由于S對于Ag核的刻蝕作用引起的。

但是近期的研究結果更傾向于發光金屬納米團簇的發光機理是由于配體到金屬的電荷轉移引起的。我們對于PMVEM-Ag NCs檢測GSH的機理也進行了研究。PMVEM-Ag NCs對于一種與GSH類似的分子巰基琥珀酸(MSA)的響應如圖2(a)所示。MSA分子與GSH分子有著相同數目的羧基(—COOH)、巰基(—SH)、但不含N原子。由圖2(a)可見、隨著MSA分子濃度的增加、PMVEM-Ag NCs的熒光強度逐漸減弱、但是熒光峰位置一直位于530 nm處。由于MSA的巰基(—SH)與Ag絡合作用很強、MSA分子可以刻蝕Ag NCs使團簇的尺寸減小。在MSA加入之后、PMVEM-Ag NCs的熒光只是強度減弱而熒光峰位置不變的實驗現象再次證明了Ag NCs的發光機理為配體到金屬的電荷轉移、而不是量子限域效應。所以PMVEM-Ag NCs的發光機理是由于羧基到銀原子的電荷轉移。加入MSA之后、MSA的巰基(—SH)與Ag的強絡合作用破壞了羧基到銀原子的電荷轉移通道以及原始的團簇結構、使得PMVEM-Ag NCs熒光強度不斷減弱直至消失、而MSA上中羧基(—COOH)與Ag的絡合發出的熒光與PMVEM中羧基(—COOH)絡合發出的熒光一致、所以熒光一直處于530 nm處不變。

PMVEM-Ag NCs對于GSH和MSA分子響應的對比關系如圖2(b)所示。GSH除了帶有與MSA相同數目的巰基(—SH)與羧基(—COOH)之外、還帶有氮(N)。GSH與PMVEM-Ag NCs相互作用過程中、巰基(—SH)與Ag的強絡合能力使GSH分子能與團簇結合在一起、GSH上羧基、N原子同時也與Ag靠近并產生相互作用。GSH中羧基(—COOH)與Ag的絡合發出的熒光與PMVEM中羧基(—COOH)絡合發出的熒光一致。但是、GSH中的N原子與Ag絡合產生了新的電子躍遷通道、產生的熒光位置大約在420 nm左右。所以、隨著GSH濃度的增加、體系的熒光峰逐漸藍移。比較Fig.2(b)中相同檢測物濃度(GSH/Ag=5%與MSA/Ag=5%、GSH/Ag=10%與MSA/Ag=10%)的曲線、可見相同檢測物濃度下的GSH比MSA體系的發光更強、這是因為GSH中的N與Ag配合后提供了比MSA更多的電子躍遷通道。所以PMVEM-Ag NCs的熒光特性對于檢測物分子含有巰基(—SH)、羧基(—COOH)、和N原子的官能團及數目均有響應。值得注意的是、雖然凡是含有巰基(—SH)的分子都會對熒光探針具有刻蝕作用、從而導致熒光猝滅； 但是水溶性很弱的分子或者與Ag絡合后水溶性不強的分子、盡管含有N原子、也難以在水相中觀測到熒光峰有規律穩定移動的現象、檢測結果表現為快速猝滅熒光或者熒光峰移動現象不明顯。這決定了PMVEM-Ag NCs的光譜響應特性對于檢測物GSH分子具有很好的識別性。

2.3 檢測的特異性

圖3 對照實驗。加入不同對照分子引起的PMVEM-Ag NCs的熒光峰值位置變化(a)和熒光強度變化(b)。(目標分子摩爾百分比為20%、激發波長為355 nm)I和I0分別表示加入不同對照分子后和未加入的熒光強度

Fig.3 The control group experiments. The variations of fluorescence peak positions(a)and fluorescence intensities (b)of PMVEM-Ag NCs corresponding to different detection target. (The molar concentration ratio is 20%,and the excitation wavelength was fixed at 355 nm)IandI0represent the fluorescence intensities with and without target samples,respectively

3 結 論

通過一種簡單的合成步驟、我們制備了一種銀納米團簇作為檢測GSH的熒光探針。通過觀測銀納米團簇的熒光峰位置移動以及熒光強度變化、發展了一種對GSH探測的新方法。這種檢測方法對GSH具有非常好的特異性、濃度檢測更精確、響應非?？?。對照實驗表明、該探針對GSH具有較高的選擇性、對于多種鹽離子及氨基酸等不敏感。此外、我們還討論了該探針的探測機理。該研究為有針對性的開發新型探針具有重要的指導作用。由于Ag NCs具有很好的生物兼容性的優點、進一步的研究有望實現細胞內的GSH檢測及成像、并拓展更多的應用。

[1] Monostori P,Wittmann G,Karg E,et al. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences,2009; 877(28): 3331.

[2] Samiec P S,Drews-Botsch C,Flagg E W,et al. Free Radical Biology and Medicine,1998,24(5): 699.

[3] Cai Q Y,Li J,Ge J,et al. Biosensors & Bioelectronics、2015; 72: 31.

[4] Saha A,Jana N R. Analytical Chemistry、2013; 85(19): 9221.

[5] Patterson A D,Li H,Eichler G S,et al. Analytical Chemistry、2008; 80(3): 665.

[6] Kubalczyk P,Bald E. Electrophoresis,2009、30(13): 2280.

[7] Niu L Y,Chen Y Z,Zheng H R,et al. Chemical Society Reviews,2015; 44(17): 6143.

[8] Schaferling M,Angewandte Chemie-International Edition、2012、51(15): 3532.

[9] Jin R C,Qian H F,Wu Z K,et al. Journal of Physical Chemistry Letters,2010; 1(19): 2903.

[10] Diez I,Ras R H A. Nanoscale,2011; 3(5): 1963.

[11] Yeh H C,Sharma J,Han J J. Nano Letters,2010,10(8): 3106.

[12] Zhang Q B,Xie J P,Yu Y,et al. Nanoscale,2010,2(10): 1962.

[13] Chen Y T,Yang T Q,Pan H F,et al. Journal of the American Chemical Society,2014,136(5): 1686.

[14] Mrudula K V,Bhaskara Rao T U,Pradeep T. Journal of Materials Chemistry,2009,19(25): 4335.

*Corresponding author

Precise and Rapid Detection of Glutathione by Using Novel Fluorescent Ag Nanoclusters

HUANG Ke-han,QIN Cui-fang,CAO Xiao-dan,YANG Tai-qun,CHEN Yu-ting,ZHANG San-jun,PAN Hai-feng*,XU Jian-hua

State Key Laboratory of Precision Spectroscopy、East China Normal University、Shanghai 200062、China

Glutathione (GSH) is an important three-peptide molecule,which has the functions of antioxidation and detoxification,and plays a crucial role in the fields of biology,medicine and food science. It is involved in many important biochemical reactions in cells and body fluid,and the changes of GSH content reflect the specific health problems of human body. Current methods of GSH detection are always complicated,time-consuming and expensive instrument depended,such as surface enhanced Raman spectroscopy (SERS),electrochemical analysis,high performance liquid chromatography (HPLC) and so on. The probe’s photochemical properties can be modified by the reaction between GSH and nanoclusters,which will result in the changes of fluorescence intensity and wavelength. In this paper,a new method to realize precise and rapid GSH detection is developed by using silver na-noclusters as a fluorescent probe,and simultaneously measures the probe’s fluorescence intensity and wavelength. The synthesis of the fluorescence probe reported in this paper possesses the advantages of steps-simple and pollution free,and the GSH detection method has faster response,more accurate measurement and smaller relative error over the traditional methods. The good specificity of GSH detection among other molecules with the similar structure is further proved in control group experiments by comparing the differences of their fluorescence intensities and wavelength. The measurement accuracy is fully assured due to the insensitivity of the probe to a variety of salt ions and amino acids. This technique can be further employed in the intracellular detection and imaging of GSH.

Fluorescence spectral analysis; Glutathione detection; Fluorescent probe; Silver nanoclusters

Oct. 27,2015; accepted Feb. 10,2016)

2015-10-27、

2016-02-10

國家自然科學基金項目(61178085)和上海市自然科學基金項目(15ZR1410100)資助

黃科翰、1987年生、華東師范大學精密光譜科學與技術國家重點實驗室碩士研究生 e-mail: 271550179@qq.com *通訊聯系人 e-mail：hfpan@phy.ecnu.edu.cn

O641; O649

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3973-05