pH、GSH雙敏感型膠束的制備及其載藥性能研究*

余麗麗，姚 琳，蘇 力，丁淑梅，田洪玉

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

聚合物膠束作為藥物載體的一個重要優勢是可在親水段或疏水段引入各種敏感性基團(pH[1]、溫度[2]、氧化還原[3]、光[4]等)，以構建刺激響應型藥物載體。

pH 敏感型聚合物膠束是目前研究較為廣泛的一種刺激響應型藥物載體，該類載體的設計主要是基于腫瘤細胞附近組織液的pH值比正常組織處低這一顯著特點[5]。因此通過聚合物膠束的酸敏感設計有望實現抗癌藥物在腫瘤組織處靶向釋放。如Kataoka等[6]利用腙鍵將抗癌藥物阿霉素(DOX)連接到膠束的疏水段。

谷胱甘肽(GSH)是生物體內的一種抗氧化劑，在細胞內外的濃度差異巨大[7]，二硫鍵在由GSH提供的還原環境中會發生斷裂生成巰基[3]，因此二硫鍵常被引入到膠束的結構設計中以實現藥物的GSH敏感性釋放。

據此，作者通過原子轉移自由基聚合(ATRP)在兩親聚合物結構中引入具有酸敏感性的甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAM)單體和含二硫鍵的交聯劑(CL)，合成具有pH-GSH雙重敏感性的兩親性聚合物PEG-PDEAM-CL。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

雙(2-羥基乙基)二硫醚：質量分數為98%，西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)；甲基丙烯酰氯：質量分數為95%、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAM)：質量分數為99%、五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)：質量分數為99%、溴化亞銅(CuBr)：質量分數為99%、中性氧化鋁：AR、均為阿拉丁試劑；聚乙二醇單甲醚-1900：質量分數為98%、2-溴-2-甲基丙酰溴：質量分數為97%，阿法埃莎中國化學有限公司；氯仿-d：質量分數為99.8%，廣州希凱生物科技有限公司；1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)：質量分數為98%，北京伊諾凱科技有限公司；L-還原型谷胱甘(GSH)：質量分數為99%，上海源葉生物科技有限公司；四氫呋喃(THF)用CaH2重蒸。

旋轉蒸發儀：RE-2000A，鞏義市予華儀器有限責任公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱鼓風干燥箱：101-O，北京科偉永興儀器有限公司；紫外可見分光光度計：UV-2102 PCS，上海尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PEG-PDEAM-CL的合成及表征

根據文獻制備聚合物合成所需要的交聯劑(CL)[8]和引發劑(PEG-Br)[9]。

以DEAM(4.957 mmol)為單體，PEG-Br(0.1 mmol)為引發劑，PMDETA(0.435 mmol)為配體，CuBr(0.145 mmol)為催化劑，CL(0.5 mmol)為交聯劑，甲醇(5 mL)為溶劑，通過ATRP聚合反應合成PEG-PDEAM-CL，見圖1。

圖1 PEG-PDEAM-CL的合成

具體步驟如下：在反應管中依次加入引發劑、配體、催化劑、交聯劑、溶劑、磁子，密閉瓶口。真空泵抽氣，充氮氣(多次重復操作)。在氮氣的保護條件下，用注射器加入單體DEAM，油浴60 ℃反應20 h。反應結束后，產物以二氯甲烷(DCM)為洗脫劑過中性氧化鋁柱，收集洗脫液，40 ℃濃縮。少量DCM溶解，在冰浴下加入10 mL 石油醚(PE)沉降，收集沉淀。35 ℃干燥，得產物PEG-PDEAM-CL。稱取5 mg PEG-PDEAM-CL，氯仿-d溶解后1H-NMR表征。

1.2.2 PEG-PDEAM-CL膠束的CMC值的測定

以THF為溶劑配制1 mg/mL的聚合物母液和5×10-2mmol/mL DPH母液。

取9個棕色小瓶，加入50 μL DPH母液，分別加入20、50、100、300、400、500、600、800 μL的聚合物母液，添加THF至1 mL。攪拌10 min后緩慢滴加5 mL pH=8.0的緩沖液(20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，簡稱緩沖液)，攪拌30 min后，過0.45 μm微孔濾膜，40 ℃濃縮至2 mL。得到聚合物質量濃度分別為10、25、50、150、200、250、300、400 μg/mL的溶液。在200～600 nm掃紫外全波，確定λmax，并以吸光度(A)為縱坐標，聚合物質量濃度(ρ)為橫坐標作圖確定CMC。

1.2.3 DOX標準曲線的繪制

以去離子水為溶劑，配制5、10、15、20、30、40 μg/mL的不同質量濃度的DOX水溶液，在485 nm波長下測其A，并以質量濃度為橫坐標，A值為縱坐標繪制DOX標準曲線。

1.2.4 聚合物膠束的制備

溶液1：將20 mg聚合物溶于1 500 μL 的THF和500 μL的二甲基甲酰胺(DMF)混合溶劑中；

溶液2：將2.5 mg DOX溶于500 μL的DMF中，再向體系中滴入2滴三乙胺(TEA)；

溶液3：將溶液2加入到溶液1中，攪拌30 min。

將溶液3在磁力攪拌條件下緩慢的滴加至7.5 mL pH=8.0的緩沖液，攪拌1 h，減壓蒸餾除去THF。用250 mL pH=8.0的緩沖液透析除去游離的DOX，每1 h換一次透析液，透析6 h后，將樣品定容至20 mL，即為載藥膠束樣品。

1.2.5 膠束的藥物包封率和載藥量的測定

取0.5 mL的載藥膠束40 ℃減壓蒸餾除去溶劑，加入2 mLV(DMSO)∶V(DCM)=1∶1的混合溶劑，超聲溶解30 min。在485 nm波長下測其吸光度值。計算載藥膠束的包封率及載藥量。

(1)

(2)

1.2.6 載DOX膠束的體外釋藥研究

取載藥膠束4 mL于透析袋內，放入20 mL透析液內，在37 ℃下進行藥物釋放。間隔時間取2 mL透析液測定485 nm處吸光度，并補充空白透析液2 mL。因DOX為疏水性藥物，故釋藥所用透析液均需加吐溫60增溶，每20 mL透析液加125 μL 吐溫60。

(1) pH值響應藥物釋放特性研究

以pH=2.2、5.0、7.4 三種緩沖液作為釋放介質，考察載藥膠束的釋藥動力學過程。

(2)c(GSH)響應藥物釋放特性研究

以c(GSH)=0、0.02、5 mmol/L三種緩沖液作為釋放介質，考察載DOX膠束的釋藥動力學過程。

2 結果與討論

2.1 PEG-PDEAM-CL的1H-NMR圖譜分析

PEG-PDEAM-CL的1H-NMR圖譜見圖2。

δ圖2 PEG-PDEAM-CL的1H-NMR圖譜

其中約3.59～3.72，4.16，1.86的信號分別歸屬于PEG結構中的—CH2CH2O—，—CH2O—，以及通過2-溴異丁酰溴引入的CH3—，PEG結構中CH3O—信號被覆蓋于—CH2CH2O—信號下，約2.65～2.78的信號歸屬于單體結構中的—NCH2CH2O—，約2.73的信號歸屬于單體結構中的—NCH2CH2O—和交聯劑結構中的—OCH2CH2S CH2CH2SCH2CH2O—，約0.93～1.32的信號則歸屬于單體結構中5，6，8碳上的氫和交聯劑結構中的9碳上的氫。

2.2 聚合物膠束CMC值的確定

聚合物膠束的CMC值的確定見圖3。

ρ(聚合物)/(μg·mL-1)圖3 聚合物的CMC值的確定

載DPH聚合物膠束的λmax=262 nm，從圖3中可以看出，在262 nm波長下，吸光度值在ρ(聚合物)=88.24 μg/mL處，有較大的轉折，所以此濃度即為該聚合物膠束的CMC值。

2.3 DOX的標準曲線

DOX的標準曲線見圖4。

ρ(DOX)/(μg·mL-1)圖4 DOX的標準曲線

由圖4可以得出DOX標準曲線的回歸方程為A=0.021 6-0.004 9，R2=0.999 3，說明ρ(DOX)=5～40 μg/mL，線性良好，可以進行定量分析。

根據DOX標準曲線，及公式(1)、(2)計算出最大載藥量為8.78%，相應的包封率為70.26%。

2.4 載藥膠束的體外釋藥性能

2.4.1 pH值對載DOX膠束的釋放特性的影響

載DOX膠束在不同pH值環境中的釋藥曲線見圖5。

t/min圖5 載藥膠束在不同pH值環境中的釋藥曲線

由圖5可以看出，在不同pH值環境中，載藥膠束中的DOX釋放均呈上升趨勢，且在pH=2.2的透析液中釋放最好，12 h累積釋藥率可達100%，pH=5.0次之，pH=7.4最小。在正常組織或血液中，細胞液的pH≈7.4，從圖5中可知，在pH=7.4的環境下，4 h的釋藥率不到30%，說明該載藥膠束在正常組織中，穩定性較好。從不同pH值環境下釋藥的情況來看，環境酸度越高，釋藥率越大，說明在酸性條件下載藥膠束釋藥速度大于在堿性條件下的釋藥速度。這是由于載DOX膠束中含有叔胺基團，具有酸敏性，在酸性條件下，膠束尺寸會明顯增大，進而導致其對DOX的釋放速度大大加快。

2.4.2 c(GSH)對載藥膠束的釋放特性的影響

載藥膠束在不同濃度GSH環境中的釋藥曲線圖見圖6。

由圖6可見，在不同GSH濃度環境中，載藥膠束中的DOX釋放均呈上升趨勢，且在c(GSH)=5 mmol/mL環境下的釋藥性能最好，12 h累積釋藥率可達100%，在c(GSH)=0.02 mmol/mL環境下的釋藥性能次之，不含GSH的環境中釋藥性能最差。說明載藥膠束在較高濃度GSH條件下的釋藥速度大于在較低濃度GSH的條件下的釋藥速度。這是由于聚合物膠束結構中含有二硫鍵，在還原環境中二硫鍵發生斷裂轉變成巰基，膠束結構重新組裝促使 DOX 快速地從膠束中釋放出來。

t/min圖6 載藥膠束在不同c(GSH)環境中的釋藥曲線

3 結 論

(1) 通過ATRP反應合成具有pH-GSH雙重敏感性的兩親性聚合物PEG-PDEAM-CL，通過1H-NMR對其結構進行了表征；

(2) 采用透析法將DOX載入聚合物膠束，測定其最大載藥量為8.78%，包封率為70.26%；

(3) 并在不同pH(pH=2.2、5.0、7.4)環境條件及不同c(GSH)下(0、0.02、5 mmol/L)進行體外釋藥實驗，研究兩種響應行為對藥物控制釋放的協同作用。研究發現，載DOX聚合物膠束在酸性條件下及高濃度的GSH條件下釋放速率較快，具有pH-GSH雙重敏感性。

參 考 文 獻：

[1] 尤靜,余麗麗,姚琳,等.酸敏感型兩親性聚合物的制備和釋藥性能研究[J].化工新型材料,2014,42(01):40-42.

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