花生溫度誘導載脂蛋白基因AhTIL1的克隆和表達研究

鐘瑞春李婷婷唐榮華王興軍李翠侯蕾趙傳志

（1.廣西農業科學院經濟作物研究所，南寧 530007；2.山東省農業科學院生物技術研究中心 山東省作物遺傳育種與生態生理重點實驗室，濟南 250100；3.山東大學生命科學學院，濟南 250100）

花生溫度誘導載脂蛋白基因AhTIL1的克隆和表達研究

鐘瑞春1李婷婷2，3唐榮華1王興軍2，3李翠2侯蕾2趙傳志2，3

（1.廣西農業科學院經濟作物研究所，南寧 530007；2.山東省農業科學院生物技術研究中心 山東省作物遺傳育種與生態生理重點實驗室，濟南 250100；3.山東大學生命科學學院，濟南 250100）

溫度誘導的載脂蛋白（temperature induced lipocalins，TILs）與植物在熱、冷、光、氧化等脅迫下的穩定性相關，旨在克隆花生中的溫度誘導的載脂蛋白基因，分析其在響應低溫、高溫中的作用。從花生cDNA文庫中篩選到一個TIL候選基因，命名為AhTIL1，通過PCR擴增獲得了其基因組和候選啟動子的序列，并利用實時定量PCR等方法檢測了該基因在花生不同組織、種子不同發育時期和溫度脅迫下的相對表達量。序列分析結果表明，該基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為 558 bp，編碼185個氨基酸。生物信息學分析顯示，推測的AhTIL1蛋白質相對分子質量為21.4 kD，等電點為6.78。序列比對結果顯示，該蛋白氨基酸序列同其他物種TIL蛋白顯示出很高的同源性。對候選啟動子預測結果表明，該基因的候選啟動子包含ACE、Box4、G-box、GAG-motif等與光反應相關的調控元件以及與ABA、水楊酸、赤霉素、厭氧等相關的順式調控元件?；蛐酒蚏NASeq結果表明，該基因在花生的根、莖、葉、花、果針、種子中均有表達，在花中表達量最高，莖中次之，在根中表達量最低；AhTIL1在果針入土后表達量下降，隨著莢果的膨大和種子的成熟，AhTIL1的表達量逐漸增加。實時定量PCR結果證明，AhTIL1在高溫和低溫誘導3、6、12和24 h后上調表達，在48 h后表達量下降。AhTIL1可能在花生響應低溫、冷脅迫中發揮著重要的作用。

花生；溫度誘導載脂蛋白；基因克??；表達分析

花生（Arachis hypogaea L.）是我國重要的油料作物和經濟作物，發展花生生產對于保障我國糧油安全具有重要意義?；ㄉN植和生產過程中經常受到不利環境因素的影響，例如鹽脅迫、高溫脅迫等都嚴重影響花生的產量和品質［1-3］，干旱脅迫不僅影響花生的產量，而且也容易造成黃曲霉毒素的污染［1］。越來越多的研究表明，溫度誘導的載脂蛋白（TIL）對于植物響應溫度脅迫具有重要的作用。

載脂蛋白廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一類具有多種功能的胞外分泌小分子蛋白質［4，5］，最顯著的特點是具有3個保守的SCR（Structurally conserved region）結構域以及由8條反向平行的折疊片層形成的β桶狀結構［6］。在植物中，載脂蛋白可以分為溫度誘導的載脂蛋白（Temperature induced lipocalins，TILs）和葉綠體載脂蛋白（Chloroplastic lipocalin，CHL）。植物TIL和CHL在序列上和哺乳動物的載脂蛋白（Apolipoprotein D）、細菌的載脂蛋白（Lipocalin Blc）和昆蟲的Lazarillo protein蛋白同源［7］。植物在生長過程中會經常面對低溫、高溫、干旱、鹽堿等各種不利的環境因素，在受到脅迫后，植物體內一些基因的表達會被誘導，間接或者直接地參與植物的抗逆反應。在擬南芥中，溫度誘導的載脂蛋白（TIL）被認為是增加耐熱性的必要因子［8］。Kawamura等［9］發現在低溫誘導下擬南芥TIL蛋白的積累顯著增加［9］，隨后的研究進一步表明在擬南芥和水稻中TIL基因在低溫和高溫下均上調表達［10］。反向遺傳學證據表明，當TIL被敲除后，突變體對除草劑、溫度和光照更加敏感，在溫度驟然減低、除草劑處理，或將植物由黑暗環境轉移到光照環境下存活率大大降低。相反，過量表達TIL能夠增強擬南芥在冷凍、除草劑和光照脅迫下的適應性［11］。最近的研究證實，TIL蛋白可以通過調節離子的平衡保護葉綠體的穩定，被認為是增加植物耐鹽性的重要因子［12］。葉綠體載脂蛋白基因（CHL）的表達也響應干旱、光照、除草劑、ABA等脅迫，但對鹽脅迫和溫度脅迫并不敏感［13］。TIL和CHL在響應逆境脅迫的分工不同，但兩者在保護脂質和延長種子壽命上都發揮著重要的功能［14］。

載脂蛋白最基本的生物學功能是結合并轉運脂肪酸、類固醇、信息素、類維生素A等輸水的配體。越來越多的證據表明，載脂蛋白與植物的環境適應性密切相關?；ㄉ诜N植和儲存過程中，也會面對高溫、低溫、干旱等自然災害，但對花生中的溫度誘導的載脂蛋白卻鮮有研究。本研究以花生栽培品種魯花14號為材料，通過構建cDNA文庫和高通量測序，克隆花生AhTIL1 cDNA的全長序列；進一步獲得AhTIL1的基因組序列及其候選啟動子序列，通過生物信息學手段對其候選啟動子序列、蛋白結構等進行分析；通過實時定量PCR等手段對其在不同組織及在冷、熱處理下的表達量進行分析，旨為花生TIL基因的功能鑒定和利用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培花生品種魯花14號、大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。高保真Taq酶購自北京全式金生物公司，RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、普通Taq酶、pMD18-T Vector購自大連TaKaRa公司；引物由Invitrogen（上海）貿易有限公司合成；質粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Sangon（上海）工程技術有限公司；DNA Marker購自北京天為時代生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構建花生cDNA文庫并進行EST測序 收集花生中果針入土10-60 d的未成熟花生種子，依據RNAgent試劑盒（Promega）的方法提取總RNA和分離純化mRNA，按pBluescript II cDNA（Stratagene，USA）的試劑盒構建花生種子的cDNA文庫?；ㄉ鶨ST的序列測定采用T3和T7通用引物，EST的常規測序由山東省農業科學院測序中心完成；EST序列的功能注釋通過與已知蛋白進行BlastX比對完成。

1.2.2 AhTIL1基因的克隆 依據花生EST功能注釋結果，挑取與其它植物的TIL同源的EST序列進行重新測序，結合與其它物種TIL基因的序列比對和在線軟件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/projects/gorf）的預測結果確定AhTIL1的編碼區。根據AhTIL1的序列設計基因克隆引物pAhTIL1F：5'-GAACAACAACAACTACAACAAAA-3'和pAhTIL1R：5'-TTTATTTATAACATGGAATAACTCT-3'。將AhTIL1的cDNA序列信息與花生二倍體野生種Arachis duranensis和Arachis ipaensis全基因組序列數據庫進行比對（http://peanutbase.org/）。根據AhTIL1和野生花生基因組比對的結果設計啟動子克隆引物ppAhTIL1F：5'-TGCTAATTTTATTGATTTTG-3'和ppAhTIL1R：5'-GAACATAGAACTTGACCTTGA-3'。利用CTAB法提取花生基因組DNA，分別以基因組DNA和cDNA為模板進行PCR，條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1.5 min，31個循環；72℃ 7 min；4℃結束反應。PCR后，用1%瓊脂糖電泳檢測結果。切膠回收目的條帶DNA，連接到pMD18-T的克隆載體上進行DNA序列的測定。

1.2.3 AhTIL1的生物信息學分析 用DNAstar預測花生AhTIL1基因編碼蛋白質的氨基酸數、分子量、等電點。用在線軟件PlantCARE（http://bioinformati cs.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析AhTIL1的候選啟動子的順式元件。用多序列比對軟件ClustalW 1.83對AhTIL1和大豆、苜蓿、擬南芥等植物的TIL蛋白進行多序列同源比對和進化樹分析，輸出的文件通過BOXSHADE 3.21進行著色［15］。

1.2.4 AhTIL1基因的表達分析 花生cDNA芯片的制備和種子不同發育時期的表達譜分析由上海博星公司完成。在試驗地中收集花生根、莖、葉、花、果針和成熟種子，以及花生果針入土后（Date after pegging，DAP）15、25、35、45和70 d的花生種子，提取總RNA進行芯片雜交。以營養缽中生長兩個星期、長勢比較一致的花生植株為材料，分別用高溫（42℃）和低溫（8℃）處理花生0、3、6、12和24 h。分別提取不同處理下花生葉片的總RNA， 用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，根據AhTIL1基因的序列設計引物：ahTILRTF：5'-TCCATTCTTGCCTATCATCCC-3'，ahTILRTR：5'-CTCCTCATCTAATCGGTTCTGC-3'。用Actin基因作為內參，引物為：ahActinF：5'-GTCATCGTCATCCTCTTCTC-3'，ahActinR：5'-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3'。采用FastStart SYBR Green試劑盒（Roche）在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行PCR反應，程序為：預變性95℃ 10 min；95℃ 30 s，59℃ 1 min，35個循環；測定熔解曲線95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。每個反應設3次重復，根據熔解曲線來檢測PCR 產物的特異性，基因表達水平的測定使用相對表達，用2-△△CT的方法計算。

2 結果

2.1 基因序列克隆及序列分析

提取花生總RNA（圖1-A），反轉錄后構建cDNA文庫，從cDNA文庫中篩選并克隆到1個TIL基因（662 bp），包含一個558 bp的開放閱讀框，將其命名為AhTIL1。AhTIL1編碼186個氨基酸，其中59個為疏水氨基酸。推測AhTIL1蛋白質的相對分子質量為21.4 kD，等電點為6.78。提取了花生基因組DNA（圖1-B），通過在花生基因組中進行擴增，獲得了AhTIL1基因的基因組序列，長度為790 bp，包含1個內含子和2個外顯子（圖1-C，圖2）。

與其他植物TIL蛋白的比對結果（圖3）表明，花生AhTIL1與其它植物的TIL具有較高的同源性，與番茄的同源性高達86%，與擬南芥AtTIL1（At5g58070）的同源性為77%?；ㄉ鶤hTIL1蛋白的第11-27位氨基酸為SCRI區，通過比較發現該區段包含一段非常保守的序列“RYMGRWYEIA”。SCRII和SCRIII的保守性較差，但是分別在各自特異氨基酸“D”和“R”上非常的保守（圖3）。系統進化樹結果（圖4）表明，花生AhTIL1與番茄、煙草、蓖麻等物種中TIL的親緣關系較近，與百脈根、大豆次之。

利用PlantCARE對候選啟動子的預測結果表明，AhTIL1基因的候選啟動子包含ACE、Box4、G-box、GAG-motif等與光反應相關的調控元件，候選啟動子區域包含與ABA、水楊酸、赤霉素、厭氧等相關的順式調控元件（表1）。

圖1 花生AhTIL1基因的克隆

圖2 花生AhTIL1基因組和cDNA的序列（陰影部分為外顯子）

2.2 AhTIL1基因的表達分析

花生cDNA芯片的雜交結果（圖5-A）顯示，AhTIL1在花生根、莖、葉、花和種子中均有表達，在花中的表達量最高，莖中次之，在根中表達量最低，即地上部分（莖、葉、花、果針）的表達量要高于地下部分（根和種子）。芯片雜交檢測花生果針入土（Days after pegging，DAP）15、25、35、45和75 d AhTIL1的表達量，結果（圖5-B）顯示DAP15和DAP25時期mRNA表達水平最低，在種子成熟的中后期，隨著成熟度的增加AhTIL1的表達也隨之增加。在種子成熟后期，種子內脂肪酸等脂類物質的積累增加，載脂蛋白表達量的增加可能與轉運和保護脂類物質相關。我們通過RNA-seq的方法檢測了在即將入土果針（S1）、剛剛入土后3 d左右還未膨大的果針（S2）、入土9 d左右剛剛膨大的果針（S3）中AhTIL1的表達量，結果顯示，在S1、S2和S3中AhTIL1的相對表達水平（RPKM）分別為2.842 77、0.588 875和2.198 386。結果表明，在花生果針剛剛入土后，由于光照、機械刺激等因素的影響，AhTIL1的表達量迅速降低，但隨著花生胚胎發育的啟動和種子內物質的積累，AhTIL11的表達量又有所增加。這表明，花生AhTIL1的表達容易受到光信號的調控，同時也與種子脂質的積累相關。

圖3 花生AhTIL1與其它植物同源蛋白的序列比對

用高溫（42℃）和低溫（8℃）處理花生0、3、6、12和24 h，用實時定量PCR檢測AhTIL1的相對表達量。結果（圖6）表明，AhTIL1在高溫和低溫誘導后的表達趨勢一致，即在處理3、6、12和24 h后其表達量逐漸增加，在48 h后表達量下降。在高溫和低溫處理24 h后，AhTIL1基因的表達水平分別比對照上調6倍和3倍。結果提示，AhTIL1可能在花生響應高溫和冷脅迫過程中發揮著重要的作用。

3 討論

隨著全球變暖，農業生態環境不穩定，溫度、干旱等非生物脅迫成了制約農作物種植的重要因素。從植物中挖掘耐逆相關的基因資源，利用這些基因資源提高農作物的抗性是未來分子育種需要解決的問題。溫度誘導載脂蛋白最基本的生物學功能是與配體結合，在人、動物和微生物中的研究表明TIL與細胞膜的穩定性相關［16-18］。近年來，植物中的TIL也陸續被報道。研究結果證實，在受到低溫或高溫脅迫后，擬南芥、小麥和番茄的TIL基因均上調表達［7，9］。擬南芥TIL1-GFP融合蛋白基因轉化洋蔥表皮瞬時表達實驗表明，擬南芥TIL蛋白定位在膜上，表明植物TIL的功能可能也與膜的穩定性相關［10］。最新的研究表明，TIL還與保護種子內的脂類物質和延長種子壽命相關［14］。這些研究表明TIL可能在植物耐逆機理研究和作物分子育種中具有重要的應用潛力?；ㄉ钱愒此谋扼w（AABB，2n= 4x=40）植物，是由兩個祖先野生種A. duranensis（A基因組供體）和A. ipaensis（B基因組供體）雜交自然加倍的結果［19］。近年來隨著分子生物學和測序技術的發展，花生功能基因組學研究取得了長足的進步，從花生中已經鑒定了大量的抗逆基因［20-23］。本研究從花生中克隆了花生的載脂蛋白基因AhTIL1及其候選啟動子序列，發現該基因也響應低溫和高溫的脅迫。

圖4TIL蛋白的進化樹分析

表1 花生AhTIL1候選啟動子元件預測

在擬南芥中只有一個TIL基因，小麥中有TIL1和TIL2兩個基因，研究發現只有TIL1響應溫度脅迫，在序列上響應溫度脅迫的TIL1和擬南芥的TIL有更高的同源性［10］。我們從花生中克隆的TIL基因在序列上與小麥的TIL1更接近，而且也能響應溫度脅迫，因此，本研究將在花生中克隆的載脂蛋白基因命名為AhTIL1。我們的研究還發現，在花生野生種A. duranensis和A. ipaensis中均含有1個溫度誘導載脂蛋白同源基因，與魯花14號的AhTIL1的同源性均為97%，僅從編碼區序列上很難判斷該基因來源于哪一個野生種。然而，有意思的是在候選啟動子區域，AhTIL1與野生種A. ipaensis 100%匹配，而與A. duranensis只有60%的一致性，這表明AhTIL1可能來源于花生的B亞基因組。盡管A. duranensis中同源基因的候選啟動子在序列上與AhTIL1差異很大，但是在候選啟動子區域也有與光、ABA等相關的調控元件，說明TIL的表達和功能在二倍體祖先種和栽培種中可能具有很高的保守性。另外，在栽培花生魯花14號中可能還有一個AhTIL11的同源基因，這兩個基因的同源性可能很高，揭示這兩個基因的功能和分化將是我們下一步的工作。

圖5 花生AhTIL1在不同組織（A）和種子不同發育時期（B）的表達模式

圖6 花生AhTIL1在8℃（A）和42℃（B）處理下的表達模式

4 結論

本研究從花生中克隆了響應溫度誘導的載脂蛋白基因AhTIL1，分析了該基因的結構和啟動子元件，闡明了其在花生不同組織及種子發育不同時期的表達特性，證明該基因能夠分別響應高溫和低溫脅迫。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of Temperature Induced Lipocalin Gene AhTIL1 of Peanut（Arachis hypogaea）

ZHONG Rui-chun1LI Ting-ting2，3TANG Rong-hua1WANG Xing-jun2，3LI Cui2HOU Lei2ZHAO Chuan-zhi2，3
（1. Cash Crops Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007；2. Bio-tech Research Center，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Ecology and Physiology，Ji’nan 250100；3. College of Life Sciences，Shandong University，Ji’nan 250100）

The temperature-induced lipocalins（TILs）is correlated with the stability of plant under stress environment of hot，cold，lighting，and oxidizing. This study intended to clone the TIL gene from peanut and analyze its function in response to temperature stress. A gene encoding TIL，designated as AhTIL1，was screened from the peanut cDNA library. The relative expressions of the gene in the different tissues of peanuts，at the different stages of seeds，and under the temperature stress were detected by quantitative PCR. The results of sequence analysis showed that the length of the ORF of AhTIL1 was 558 bp，encoding 185 amino acids. The bioinformatics analysis indicated that the predicted molecular mass of encoded protein was 21.4 kD，ad pI was 6.78. Sequence alignment displayed that the amino acids of AhTIL1 were in high homology with TIL of other species. The predicted results of candidate promoter showed that the candidate gene promoter contained regulatory elements associated with the light reaction such as ACE，Box4，G-box，GAG-motif etc.，and other related cis regulatory elements such as ABA，salicylic acid，gibberellin，anaerobic etc. Microarray and RNA-seq results showed that AhTIL1 expressed in roots，stems，leaves，flowers，peg，and seeds，the highest in the flowers，second highest in the stems，and the least in the roots. After the peg penetrating into soil，the expression level of AhTIL1 decreased immediately，and then increased gradually with the enlarging and maturing of seeds. Real time quantitative PCR result proved that the expression level of AhTIL1 increased after low or high temperature treatment for 3，6，12 and 24 h，however，decreased after 48 h. These results indicated that AhTIL1 may play an important role in peanut response to temperature stress.

peanut；temperature-induced lipocalin；gene cloning；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.013

2015-06-24

國家自然科學基金項目（31101427），國家“863”項目（2013AA102602），廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科攻1222009-2c），山東省生物資源創新項目，山東省農業科學院青年英才培養計劃

鐘瑞春，男，副研究員，研究方向：花生育種和栽培，E-mail：rczhong6501@163.com；李婷婷為本文并列第一作者

趙傳志，男，副研究員，研究方向：花生基因組學和遺傳育種；E-mail：chuanzhiz@126.com