鹽芥TsGPX3基因的克隆、亞細胞定位與原核表達

王寧陳靜，2高飛李華云隋欣周宜君

（1. 中央民族大學 生命與環境科學學院，北京 100081；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100741）

鹽芥TsGPX3基因的克隆、亞細胞定位與原核表達

王寧1陳靜1，2高飛1李華云1隋欣1周宜君1

（1. 中央民族大學 生命與環境科學學院，北京 100081；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100741）

以鹽芥（Thellungiella salsuginea）為材料，獲得TsGPX3的cDNA全長序列，其開放閱讀框（ORF）序列長591 bp，編碼196個氨基酸，具有GPXs家族的3個保守的特征結構域。系統進化分析顯示，TsGPX3與同屬于十字花科的蘿卜RsGPX3、油菜BnGPX3和花椰菜BoGPX3等具有較高的同源性。構建植物表達載體pRTL2-TsGPX3-GFP，利用PEG轉化擬南芥原生質體細胞進行瞬時表達，發現TsGPX3蛋白主要定位在細胞膜上。構建原核表達載體pET-TsGPX3，采用不同濃度IPTG對轉入E.coli BL21（DE3）的pET-TsGPX3進行誘導表達，獲得了分子量約為27 kD的蛋白，該蛋白在37℃、誘導培養5 h時可獲得較高的表達量。

TsGPX3；鹽芥；亞細胞定位；原核表達

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPXs）是維持細胞內H2O2穩態的關鍵酶［1］，它通過催化還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）與H2O2反應生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）及水，從而阻止羥基自由基（·OH）的產生，避免由其引發的質膜過氧化，進而保護細胞膜結構和功能的完整性［2］。由多個成員組成的GPXs廣泛存在于動物和植物中，目前已發現植物體GPXs為誘導型表達，在不同脅迫條件下，編碼GPXs基因的mRNA呈現不同水平的表達，GPXs在植物抗氧化過程中可能具有重要作用［3，4］，因此關于植物中GPXs的相關研究備受關注，包括GPXs家族成員的獲得、結構特征的闡釋，以及應答脅迫的表達模式和亞細胞定位等［5-7］。

鹽芥（Thellungiella salsuginea）是模式植物擬南芥的近緣物種，與擬南芥具有相似的生物學特征［8］，且二者的cDNA序列同源性高達90%-95%［9，10］，但屬于鹽生植物的鹽芥卻能夠在含有500 mmol/L NaCl的高鹽環境或 -15℃的低溫條件下生存［11］，具有強耐逆性。此外由于鹽芥具有模式植物的生物學特性，因此被作為耐鹽性研究的模式植物［12，13］。研究表明，擬南芥中AtGPXs由8個成員組成，其中AtGPX3不僅可以作為氧化信號傳感器，還能在干旱脅迫下清除植物體內多余的脫落酸（Abscisic acid，ABA），響應ABA和干旱脅迫，這種雙重機制在其他植物中也具有相似性［14］。本實驗室前期對鹽芥TsGPXs家族的8個成員進行了研究，皆具有3個典型的GPXs特征結構域，同時在應答不同脅迫時表達模式不同。在8個TsGPXs成員中，只有TsGPX3具有跨膜結構域，屬于分泌蛋白，亞細胞定位預測分析顯示可能定位在內質網或質膜上［7］。本研究通過構建植物表達載體、利用PEG介導擬南芥原生質體的瞬時表達進行TsGPX3亞細胞定位研究；構建原核表達載體，對蛋 白表達條件進行初步研究，旨在為進一步研究TsGPX3與鹽芥抗逆性關系及植物GPXs的功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽芥山東生態型種子為本實驗室保存。Trizol試劑購自Invitrogen公司，反轉錄酶M-MLV、pGEM-T載體、pET28a、限制性內切酶Nde I和Sal I購自Promega公司，大腸桿菌（Escherchia coli）DH5α和BL21（DE3）購自北京博邁德科技發展有限公司，pRTL2表達載體由北京師范大學惠贈，限制性內切酶Xho I和Xba I購自Fermentase公司，ECL試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，考馬斯亮藍R-250購自北京百泰克生物技術有限公司，PVDF膜購自Millipore公司，辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，根據鹽芥TsGPXs蛋白序列設計的鹽芥TsGPX特異抗體（TsGPX-A）由北京華大蛋白質研發中心制備。

1.2 方法

1.2.1 材料準備 室內培養鹽芥實生苗，培養基質為營養土∶蛭石= 3∶1的混合土，培養條件為光周期16 h/d，光照強度93 μmol/（m2·s），相對濕度60%/80%（晝/夜），溫度為23℃/18℃（晝/夜），用Hoagland營養液澆灌。生長8周后，以Hoagland營養液配制300 mmol/L NaCl溶液，采用根灌法處理鹽芥幼苗12 h后取樣，迅速凍于液氮中，保存于-80℃，用于總RNA的提取。

1.2.2 鹽芥總RNA的提取與鹽芥TsGPX3基因全長的獲得 采用Trizol法提取鹽芥總RNA。以鹽芥總RNA為模板，用M-MLV反轉錄酶合成cDNA，操作步驟按說明書進行。

根據本實驗室前期獲得的TsGPX3基因序列設計引物，引物序列為F1：5'-TGTCGATGCCTAAATCAAGC-3'/ R1：5'-GAAAATGAGATTCACACTGGTACTC-3'。以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，共30個循環；72℃延伸7 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶，回收產物與pGEM-T載體連接，轉化E.coli DH5α感受態細胞，并送至北京華大基因公司進行測序。

1.2.3 鹽芥TsGPX3系統進化分析 在NCBI搜索與TsGPX3同源性較高的16種植物GPX3序列，采用MEGA 5.0進行系統進化分析。

1.2.4 鹽芥TsGPX3的亞細胞定位 對TsGPX3基因序列和含有綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）的植物表達載體pRTL2-GFP進行酶切圖譜分析，設計含酶切位點的引物F2：5'-CCGCT CGAGCGATGCCTAAATCAAGCACTTGG-3'（下劃線部分為Xho I的酶切位點）/ R2：5'-GCTCTAGATCA AGCAGATGCCAATAGCTTC-3'（下劃線部分為Xba I的酶切位點）。利用限制性內切酶Xho I 和Xba I將TsGPX3構建入pRTL2的C端GFP載體中，獲得重組質粒pRTL2-TsGPX3-GFP，轉化至E.coli DH5α中，菌液PCR鑒定與測序驗證。

制備擬南芥葉片細胞的原生質體，將鑒定正確的重組質粒pRTL2-TsGPX3-GFP和空載體pRTL-GFP分別以PEG介導轉化擬南芥原生質體，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP標簽的表達。

1.2.5 鹽芥TsGPX3的原核表達 設計含有酶切位點的引物F3：5'-GGGAATTCCATATGCGATGCCTAAATCAAGCACTTGG-3'（下劃線部分為Nde I酶切位點）/ R3：5'-ACGCGTCGACTCAAGCAGATGCCAATAGCTTC-3'（下劃線部分為Sal I的酶切位點）。利用限制性內切酶Nde I和Sal I將 TsGPX3構建入pET28a載體中，獲得重組質粒pET-TsGPX3。將重組質粒pET-TsGPX3和pET28a空載體分別轉化至E.coli BL21（DE3）中，篩選陽性克隆進行酶切與測序驗證。

分別將含有重組質粒pET-TsGPX3和空載體pET28a的E.coli BL21（DE3）接種于含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的10 mL LB液體培養基，于37℃條件下振蕩培養。在菌液到達對數期（OD600為0.8左右）時加入終濃度為1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導。分別取1 mL菌液，在37℃下分別培養1、2、3、4和5 h，以確定最佳表達時間。分別取1 mL菌液，在16℃、28℃和37℃分別培養5 h時，以確定最佳表達溫度。分別收集上述條件下所得菌體。每個樣品取5 μL進行SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色，檢測融合蛋白的表達情況。

1.2.6 誘導表達融合蛋白的Western blotting檢測 SDS-PAGE電泳后，將未進行染色的凝膠轉硝酸纖維素膜（轉膜15 V，30 min），加入5%脫脂奶封閉液，于 100 r/min的搖床上室溫封閉30 min。加入一抗（TsGPX-A抗體），于100 r/min的搖床上37℃孵育1 h，用TBST洗3遍，5 min/次。加入二抗（HRP標記的山羊抗小鼠IgG），于100 r/min的搖床上37℃孵育1 h，用TBST洗3遍，5 min/次。用ECL試劑盒進行顯色，將試劑盒A、B液1∶1混合配成2 mL溶液，室溫孵育PVDF膜1 min，用凝膠成像系統觀察。

2 結果

2.1 鹽芥TsGPX3基因的擴增與系統進化分析

以引物序列F1/R1 擴增TsGPX3的全長cDNA序列，大小為776 bp，其中6-596 bp為開放閱讀框（ORF），編碼196個氨基酸（圖1）。TsGPX3蛋白的理論相對分子量為23.258 kD，理論等電點為7.33。TsGPX3具有植物GPX蛋白活性中心的3個保守Cys（C）殘基以及3個保守特征結構域（催化結構域NVASKCG、標志性基序ILAFPCNQF和PHGPX的特征基序KWNFAKFL），且3個保守結構域中各含有1個催化氨基酸殘基，即C、Q和W（圖2）。

圖1 鹽芥TsGPX3基因全長cDNA的PCR擴增產物

圖2 TsGPX3的核苷酸及推測的氨基酸序列

為了研究TsGPX3的進化關系，采用MEGA 5.0對TsGPX3及與TsGPX3同源性較高的16種植物GPX3序列進行系統進化樹分析，結果（圖3）顯示，鹽芥TsGPX3與同屬于十字花科的蘿卜（Raphanus sativus）RsGPX3、油菜（Brassica napus）BnGPX3、花椰菜（Brassica oleracea）BoGPX3、擬南芥（Arabidopsis lyrata）AlyGPX3和擬南芥（A. thaliana）At-GPX3同源性較高，聚為一類。與非十字花科的高粱（Sorghum bicolor）SbGPX3、玉米（Zea mays）ZmGPX3、水稻（Oryza sativa）OsGPX3、大麥（Hordeum vulgare）HvGPX3、藍桉樹（Eucalyptus globulus）EglGPX3、巨桉（Eucalyptus grandis）EgrGPX3以及小麥（Triticum aestivum）TaGPX3-1A、TaGPX3-1B、Ta-GPX3-1D的同源性較低。另外，研究發現，上述物種與萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CreGPX3和小立碗蘚（Physcomitrella patens）PpaGPX3的同源關系均較遠。

圖3 鹽芥TsGPX3及其他植物GPX3序列的系統進化分析

2.2 TsGPX3基因的亞細胞定位

將pRTL2空載體和經過鑒定的pRTL2-TsGPX3-GFP載體以PEG介導分別轉化擬南芥原生質體，結果見圖4。pRTL2空載體亞細胞定位結果（圖4-A）顯示，GFP熒光蛋白在細胞的各個部位都有表達，顯示清晰的GFP綠色熒光信號。pRTL2-TsGPX3-GFP載體亞細胞定位結果（圖4-B）顯示，TsGPX3∷GFP融合蛋白僅在細胞膜位置產生熒光，由此推測TsGPX3基因所編碼的蛋白主要定位在細胞膜上，與生物信息學預測結果基本一致。

2.3 鹽芥TsGPX3蛋白的誘導表達

以未被IPTG誘導的pET28a空載體為對照，將經過鑒定的含有重組質粒pET-TsGPX3的E.coli BL21（DE3）在IPTG誘導下表達1、2、3、4和5 h后進行SDS-PAGE電泳，結果（圖5-A）顯示，含有pET-TsGPX3表達載體的E.coli BL21（DE3）在不同誘導條件下、在27 kD附近都出現1條新的特異條帶，與TsGPX3預測大小基本一致，pET28a空載體沒有特異蛋白表達。在5個誘導時間（1、2、3、4和5 h）處理中，TsGPX3融合蛋白的表達呈逐漸上升趨勢，在5 h達到最高；在3個處理溫度（16℃、28℃和37℃）下表達5 h，TsGPX3融合蛋白的表達量逐漸增加，在37℃時達到最高。采用Western blotting對誘導表達的融合蛋白進行驗證，誘導表達的融合蛋白能夠與抗體發生特異反應，證明表達產物為目的蛋白（圖5-B）。

3 討論

作為生物體抗氧化酶防御體系的關鍵酶之一，谷胱甘肽過氧化物酶（GPXs）通過多種信號途徑在植物響應逆境中發揮重要作用［15］。本研究獲得的鹽芥TsGPX3基因所編碼的蛋白含有植物GPXs蛋白活性中心的3個保守Cys（C）殘基以及植物GPXs的3個保守特征結構域，且在3個保守結構域中均具有3個GPXs催化殘基Cys70（C）、Gln101（Q）和Trp159（W），說明本研究獲得的TsGPX3屬于植物GPXs家族。與其他植物GPX3進行系統進化分析結果顯示，TsGPX3與同屬于十字花科物種的GPX3親緣關系最近，而與非十字花科物種的GPX3親緣關系較遠，說明在進化過程中，不同科屬植物物種的GPX3序列發生了一定的變化。

圖4 空載體（A）及鹽芥TsGPX3（B）亞細胞定位結果

圖5 pET-TsGPX3在E.coli BL21（DE3）中表達的SDSPAGE檢測（A）和Western blotting鑒定（B）

植物GPXs家族有多個成員，不同成員的亞細胞定位與其行使的生物學功能相關。采用PSORT 在線分析軟件進行鹽芥TsGPXs 8個成員的亞細胞定位分析結果顯示，TsGPX1和TsGPX7定位在葉綠體中，TsGPX2、TsGPX4、TsGPX5和TsGPX8定位在細胞質溶質中，TsGPX6定位在線粒體中，而TsGPX3定位在細胞膜和內質網膜上，且具有信號肽［7］。構建亞細胞定位載體進行亞細胞定位研究表明，鹽芥TsGPX6主要定位在線粒體和內體中［16］。本研究通過亞細胞定位研究顯示TsGPX3定位于細胞膜上，與預測基本相符。由于膜上分布眾多的載體蛋白、與細胞活動相關的離子泵、通道蛋白和蛋白受體等，因此推測TsGPX3對細胞質膜的穩定或控制蛋白轉運具有一定的作用［17］。已有研究顯示擬南芥［14］、楊樹［5］和百脈根［6］GPX3定位在細胞質中，而鹽芥TsGPX3與其不同，主要定位在細胞膜上，其不同物種的GPX3亞細胞定位差異可能與抗逆功能有關，有待進一步探究。

大腸桿菌表達系統是目前應用最為廣泛的原核表達系統［18］，但融合蛋白在該系統中的表達結果可受多種因素影響，如誘導溫度、誘導劑的濃度、誘導時間等。已有研究顯示TsGPX8的原核表達融合蛋白大小約為23 kD，最佳表達條件為37℃，誘導培養5 h［19］。本研究構建了TsGPX3的原核表達載體并進行了原核表達蛋白的分析。前期預測的TsGPX3的分子量約為23 kD，將TsGPX8與His-tag融合后分子量大約為27 kD，與原核表達電泳圖顯示的結果一致。采用Western blotting驗證誘導表達的融合蛋白，證明表達產物為目的蛋白。與TsGPX8原核表達體系的表達條件相似，從本研究實驗結果可知，TsGPX3原核表達體系在37℃，誘導培養5 h具有較高的蛋白表達量。

4 結論

鹽芥TsGPX3基因的全長cDNA序列大小為776 bp，編碼一個包含196個氨基酸的蛋白，具有植物GPXs的特征結構域。系統進化分析表明，鹽芥TsGPX3與同屬于十字花科的蘿卜RsGPX3、油菜BnGPX3和花椰菜BoGPX3等同源性較高。亞細胞定位研究顯示TsGPX3主要定位于細胞膜上。TsGPX3原核表達體系在37℃，誘導培養5 h具有較高的蛋白表達量。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning，Subcellular Localization and Prokaryotic Expression of Gene TsGPX3 from Thellungiella salsuginea

WANG Ning1CHEN Jing1，2GAO Fei1LI Hua-yun1SUI Xin1ZHOU Yi-jun1
（1. College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081；2. Institute of Forensic Science，Ministry of Public Security of P. R. China，Beijing 100741）

A cDNA of TsGPX3（Thellungiella salsuginea GPX3）was isolated from T. salsuginea，and it contained a complete ORF with 591 bp encoding 196 amino acid residues. The three conservative domains of TsGPX3 protein in GPXs family was predicted by bioinformatics analysis. Phylogenetic analysis discovered that TsGPX3 was in high homology with RsGPX3 of Raphanus sativus，BnGPX3 of Brassica napus，and BoGPX3 of B. oleracea etc.，all belonging to Brassicaceae. The plant-expressed vector pRTL2-TsGPX3-GFP was transiently expressed by transforming the protoplasts of Arabidopsis thaliana via PEG method，and it was discovered that the TsGPX3 protein was mainly located in the plasma membrane. The constructed prokaryotic vector pET-TsGPX3 was transferred into Escherichia coli strain BL21（DE3）for induced expression under different concentration of IPTG，and a 27 kD recombinant protein was highly expressed after induced for 5 h at 37℃.

TsGPX3；Thellungiella salsuginea；subcellular localization；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.014

2015-07-09

國家自然科學基金項目（31370356，31070361），中央民族大學一流大學一流學科項目（YLDX01013，2015MDTD08C），中央民族大學研究生科研創新項目（2015）

王寧，女，碩士，研究方向：植物分子生物學，E-mail：wzpn123@163.com；陳靜為本文并列第一作者

周宜君，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：queenzhou@263.net