13個中國葡萄優新品種的分子身份證構建

王慧玲閆愛玲孫磊張國軍王曉玥徐海英

（1.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093；2.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093；3.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100093）

13個中國葡萄優新品種的分子身份證構建

王慧玲1，2閆愛玲1，2孫磊1，3張國軍1王曉玥1徐海英1

（1.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093；2.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093；3.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100093）

以近年來選育的13個葡萄優新品種為試材，進行親緣關系分析，構建分子身份證，為中國葡萄品種鑒定和新品種保護提供一定的參考。利用國際通用的9對引物對供試葡萄品種進行SSR分析，并根據引物對不同品種擴增條帶分子量的大小進行賦值編碼。結果表明，該9對引物在供試葡萄品種間共檢測出48個等位基因，每對引物平均檢測到等位基因數為5.3個；期望雜合度的范圍在0.435-0.811之間；多態性信息含量變幅為0.401-0.784。同時基于SSR分析結果得到編碼各異的品種分子身份證，該分子編碼可以將13個葡萄品種進行有效區分。聚類分析顯示13個品種根據親緣關系遠近聚為不同類別。

葡萄；優新品種；SSR；分子身份證

葡萄屬葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis L.），是全球性果樹之一，品種繁多，分布廣泛。我國是世界上葡萄栽培面積較大的國家之一，目前全國入圃保存的葡萄種質資源也有2 000份左右［1］，并且每年都會有多個新品種出現，因此進行品種保護、品種鑒定及譜系分析等工作不僅對苗木繁育具有重要意義，也是保護這些品種知識產權的需要。

SSR（Simple sequence repeat）分子標記技術具有重復性好、多態性豐富、穩定性高及簡便快速等特點［2］，近年來被廣泛應用于葡萄種質鑒別［3］、遺傳多樣性分析［4，5］、親緣關系鑒定［6，7］及分子遺傳圖譜構建［8］等方面，同時也成為葡萄指紋圖譜構建的有效工具［9］。尹玲等［10］對我國近年來新育成的24個鮮食葡萄品種，利用6對國際通用的SSR熒光標記引物對其進行擴增，并利用毛細管電泳技術對產物進行分離，建立了這些葡萄品種的指紋圖譜。近幾年，研究者在遺傳圖譜基礎上提出了“分子身份證”的概念，并將它賦予品種本身作為識別品種的一個標準。分子身份證是在指紋圖譜的基礎上將種質的特征數字化，即每個種質都擁有一個屬于自己的字符串形式的代碼，達到更加簡單明了區分種質的目的。在果樹方面，研究者利用SSR標記分別構建了甜櫻桃、香蕉和桃等的分子身份證［11-13］。2013年，杜晶晶等［14］以國家葡萄品種資源圃內保存的80份葡萄種質為試材，對利用SSR標記構建葡萄種質分子身份證的方法進行了探討，證明SSR標記可以用于進行葡萄的分子身份證構建。

本研究選取北京市農林科學院林業果樹研究所選育的13個葡萄優新品種為試材，通過SSR標記分析技術，分析它們的親緣關系，嘗試構建13個品種的分子身份證，旨在為保護中國葡萄優新品種的知識產權，并為育成品種的分子鑒定奠定理論基礎，對中國葡萄遺傳育種及品種保護提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料均為北京市農林科學院林業果樹研究所選育的優新品種，共13份（表1），分別種植于所內資源圃和溫室。在四月中旬采集各個葡萄品種幼葉液氮速凍，保存于-80℃冰箱，用于基因組DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取參照Marsal等［15］的方法。從葡萄幼葉中提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Eppendorf公司生產的Bio-Photometer核酸檢測儀檢測DNA溶液的濃度與純度，并將濃度稀釋至50 ng/μL。

1.2.2 DNA擴增和電泳 本研究選取9對國際通用的SSR引物進行擴增（表2），其中6個標記（VVMD5、VVMD7［16］、VVMD27、VVS2［17］、VRZAG62及VRZAG79［18］）曾被This等［19］推薦為葡萄品種篩選的核心標記。引物由上海生工合成，每對引物合成2OD，-20℃冰箱保存備用。

DNA擴增采用20 μL體系。其中含：10×PCR buffer，引物0.25 μmol/L，模板DNA 50 ng，dNTP 0.2 mmol/L，rTaq DNA 聚合酶0.5 U。用于SSR-PCR 反應的dNTP、Taq酶、DNA Marker購自TaKaRa公司。

PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，65℃-55℃退火15 s，72℃延伸1 min，10個循環；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，25個循環；4℃保存。PCR反應在美國Bio-Rad公司生產的9600 Thermal Cycler型PCR儀上進行。然后取PCR產物4 μL進行點樣，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，膠干后在清華紫光e100 掃描儀上成像保存。

1.2.3 數據分析 采用Powermarker軟件（Version 3.25）［20］對9個SSR標記的遺傳多樣性指數進行分析。數據標準化處理方法參考陳昌文等［11］的方法。根據每對引物對不同種質擴增片段對應的分子量大小，按從小到大依次編碼為1-8。同時參考桃分子身份證的構建方法，當引物擴增的某一品種等位基因有2個時，按等位基因堿基數較小的條帶編碼進行賦值。并通過非加權配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，建立親緣關系圖。

2 結果

2.1 SSR引物擴增多態性

通過改進的CTAB方法提取全部實驗材料的基因組DNA，通過電泳和紫外分光光度計檢測，基因組DNA的濃度和純度均符合SSR實驗要求。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示，SSR擴增條帶清晰。本實驗所選用的9對SSR引物在供試葡萄品種中共檢測到48個等位基因，平均每對引物擴增的等位基因數是5.3個。最少的VVMD6和VrZAG29引物分別擴增出3個等位基因，VrZAG79擴增的等位基因數最多為8個，其中有5對引物的等位基因數超過平均數（表2）。等位基因數越多，表明該引物更能反應品種之間的差異。其中VVMD5和VVMD7對13個品種擴增結果（圖1）顯示，13個品種分別有6個等位基因。盡管9對引物的多態性不高，但是足以區分這13個葡萄品種。

利用Powermaker軟件對9個SSR標記在13個葡萄品種中的主等位基因頻率、期望雜合度、觀測雜合度及擴增位點的多態信息含量等進行了計算分析。結果（表3）表明，擴增位點的觀測雜合度在0.385-0.846之間，平均值為0.641。期望雜合度的范圍在0.435-0.811之間，平均值為0.638。多態性信息含量PIC變幅為0.401-0.784，平均為0.598。 VrZAG79引物的PIC值最高，結合期望雜合度值及等位基因數值，該引物對本研究供試葡萄品種的區分能力最強。

表1 13個葡萄品種名稱及分子身份證編碼

2.2 分子身份證構建

根據電泳結果，對9對引物在供試種質擴增的等位基因譜帶大小分布范圍進行賦值。因為本實驗中引物擴增最多的等位基因數為8，所以賦值范圍為1-8（表4）。為了保證分子身份證字符串的每位上只有1個字符，對同一引物下的擴增條帶只選擇位點較小的進行分子編碼。

根據表4中等位基因的賦值標準和各引物對品種的擴增結果，對13份供試葡萄品種進行分子編碼，結果（表1）顯示，用選取的9對引物可以將13個品種進行有效區分。但是因為品種親緣關系較近，進行分子編碼最少也需要8對引物才能夠將所有品種區分開，如瑞都紅玫和瑞都早紅的分子編碼比較相似，在第8對引物時才區分開。另外在所構建的13個品種分子身份證中，有7個品種具有至少一個特異等位基因。紫珍珠、早玫瑰香和瑞都脆霞各具有一個特異等位基因，艷紅、早瑪瑙和峰后各具有2個特異等位基因，瑞都無核怡則具有3個特異等位基因。

2.3 供試葡萄品種親緣關系分析

根據本研究所用的9對SSR引物擴增結果進行數據統計，利用POWERMAKER軟件，采用UPGMA法對所有品種進行聚類分析，聚類結果（圖2）顯示，親緣關系近的多聚為一類，如父母本相同的瑞都紅玫、瑞都早紅、瑞都脆霞和瑞都香玉聚在一起，而瑞都紅玉為瑞都香玉的芽變，也聚為一類。紫珍珠和早玫瑰香親本相同聚為一類。艷紅、早瑪瑙愛神玫瑰與香妃聚為一個大類，他們都有相同的親本玫瑰香。該聚類結果清楚地反應了品種間親緣關系的遠近。

3 討論

采用9對SSR引物對13個葡萄品種進行了分子身份證構建和親緣關系分析。平均等位基因數（5.3）、期望雜合度（0.435-0.811）和引物多態性信息含量（0.401-0.784）方面顯示，本實驗結果都較低（表3）。Guo等［21］利用相同引物在32個中國葡萄品種擴增平均位點數11.5，期望雜合度0.740-0.915，多態性信息含量0.716-0.908。本研究結果也低于Moreno-Sanz等［22］采用相同引物在西班牙品種中的擴增結果?？赡苁怯捎?3個供試葡萄品種來源于相同的育種單位，許多品種父母本相同，親緣關系較近，選育品種的性狀相似，導致品種遺傳多樣性較低。但是通過這9個分子標記，也可以將13個葡萄品種完全區分開。同時我們發現標記VrZAG79在本研究所用的13個中國葡萄品種中擴增等位基因數最多，多態信息含量最高，這與Guo等［21］在32個中國葡萄品種的實驗結果一致，表明VrZAG79可以作為區分中國葡萄品種的核心標記之一。

表2 9對SSR引物的堿基序列及擴增結果

表3 9個SSR標記在13個供試葡萄品種的遺傳多樣性

表4 SSR引物擴增基因譜帶大小/bp

在引物擴增結果的基礎上，我們采取最小等位基因編碼法［13］對13個葡萄品種進行分子編碼。得到了13個葡萄品種編碼各異的分子身份證。在桃編碼中發現親緣關系較近的品種很難區分［13］，而本研究中，對于親緣關系較近的品種通過增加引物也得到了有效區分，如瑞都紅玫和瑞都早紅的區分等。本研究對來自同一育種單位親緣關系相同或較近的品種均可被有效區分，充分說明我們所選取的引物足以區分親緣關系很近的不同材料，亦即利用SSR標記構建葡萄分子身份證具有較強的可靠性，可作為鑒別葡萄品種的一種有效方法。本實驗得出的結果在一定程度上可以作為供試品種鑒定的依據，但在后期的大量鑒定中的適用性還需進一步的驗證。如果能將分子標記和品種來源及表型性狀相結合來研究制定它們的分子身份證將會得到更加科學客觀的實驗結果。

圖1 VVMD5和VVMD7擴增的等位基因特征

圖2 13個葡萄品種基于SSR的聚類分析

4 結論

本研究采用國際通用的9對SSR引物，對13份中國葡萄優新品種進行了親緣關系分析，構建了它們的有效分子身份證，再一次表明SSR分析技術可以作為葡萄品種分子身份證構建的有效技術手段。

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（責任編輯 馬鑫）

Molecular ID Establishment of 13 Chinese Newly-developed Grape Cultivars

WANG Hui-ling1，2YAN Ai-ling1，2SUN Lei1，3ZHANG Guo-jun1WANG Xiao-yue1XU Hai-ying1
（1. Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100093；2. Beijing Engineering Research Center for Deciduous Fruit Tree，Beijing 100093；3. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture of P. R. China，Beijing 100093）

Using 13 newly-developed grape cultivars as experimental materials，the phylogenetic relationship among them were analyzed and their molecular IDs were established，which aimed to provide the references for identifying the grape cultivar and protecting the new ones. SSR analysis was carried out on the tested grape cultivars with the international commonly-used 9 pairs of primers，and the codes of each cultivar was assigned according to the molecular weight of the amplified band of different cultivar by the primer. The results showed：a total of 48 alleles and an average of 5.3 alleles per primer were detected by 9 pairs of primers. The expected heterozygosity varied between 0.435-0.811，and the information content of polymorphism ranged from 0.401 to 0.784. After alleles assignment and coded，the molecular IDs of cultivars were established，by which the 13 grape cultivars can be identified. According to the clustering analysis，13 cultivars showed clear separations due to their different parents.

grape；new cultivars；SSR；molecular ID

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.018

2015-07-21

科技創新能力建設專項（KJCX20140110，KJCX20140202）

王慧玲，女，博士，助理研究員，研究方向：葡萄分子遺傳育種；E-mail：whlhappy@aliyun.com

徐海英，女，研究員，研究方向：葡萄遺傳育種；E-mail：haiyingxu63@sina.com