一株高效鐵錳氧化細菌P1的分離鑒定及氧化條件優化

樊星 王淑婷 李春艷

（東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

一株高效鐵錳氧化細菌P1的分離鑒定及氧化條件優化

樊星 王淑婷 李春艷

（東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

利用富集培養技術從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離得到1株能夠氧化鐵錳的細菌，命名為P1。經形態特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，將菌株P1鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。利用單因素實驗探討菌株P1的生長及氧化特性；采用響應面分析方法考察接種量、溫度、pH值3個因素對菌株P1氧化特性的影響，進一步優化菌株的氧化條件。結果表明，菌株P1的最佳氧化條件：溫度28.54℃，pH7.23，接種量4.35%。在此條件下，菌株P1在錳含量為200 mg/L、鐵含量為800 mg/L的選擇性培養液中培養3 d后，錳氧化率達 93%以上，鐵氧化率達100%。

鐵錳氧化；Bacillus cereus；分離鑒定；氧化條件；響應面分析法

鐵、錳是地殼的主要構成成分，廣泛分布于自然界中。地下水在徑流地下的過程中，由于化學作用、物理作用及生物作用溶解了不同濃度的鐵、錳離子以及其他物質，地下水的優良品質受到了破壞［1］。我國北方地區地下水鐵、錳超標相對于南方較嚴重，鐵、錳超標的地區主要分布在松花江流域［2］。地下水中鐵、錳含量過高會帶來諸多危害，主要包括以下幾個方面：易使衣物染色，水有鐵腥異味，Fe2O3等鐵質沉淀物會滋長鐵細菌，阻塞管道，嚴重時會出現紅水現象；作為造紙、紡織、印染、化工、食品等生產用水會降低產品質量，腐蝕生產設備及用具；長期飲用含鐵、錳量過高的水還會嚴重影響身體健康，造成胰腺、肝臟、神經系統、呼吸系統疾病，甚至導致人體慢性中毒［3-6］。因此，含有過量鐵、錳的地下水，需要處理后才能滿足工業生產和人民生活的要求。

地下水除鐵、錳技術經歷了從自然氧化法、接觸氧化法向生物氧化法的過渡階段。由于自然氧化法和接觸氧化法在實施過程中存在許多問題，如操作流程復雜、處理成本高、運行難度大，出水水質不穩定和易造成二次污染等弊端［7］，而生物氧化法由于具有效果好，運行效果穩定，無有毒副產物之患，投資少等優點［8］更為人們所接受。目前，國內對于生物氧化法的研究主要集中在鐵氧化菌、錳氧化菌的篩選上，而對于鐵錳氧化菌的篩選研究較少，且篩選出的菌株對于錳離子的去除效果不理想［9，10］。因此，有針對性地篩選具有高效鐵錳氧化能力的菌株，將其應用于地下水處理過程具有重要意義。

本研究通過富集培養，采用特異性培養基從地下水井淤泥中篩選出具有高效鐵錳氧化能力的細菌，結合形態學、生理生化特性和16S rDNA序列分析等對其進行鑒定，利用單因素實驗探討菌株的生長及氧化特性，采用響應面分析法對該菌株的氧化條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

選用黑龍江省紅旗農場富含高鐵高錳污染物的地下水井淤泥作為微生物富集培養來源。

LB培養基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，加去離子水至1 L，pH調至7.0。

PYCM改良培養基［11］：蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.3 g，酵母浸膏0.2 g，MnSO4·H2O 0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNO30.2 g，CaCl20.1 g，（NH4）2CO30.1 g，檸檬酸鐵銨0.8 g，去離子水1 000 mL，pH6.8-7.2，滅菌20 min。固體培養基添加2%瓊脂，濕熱滅菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 高效鐵錳氧化菌的富集與分離 無菌水稀釋泥樣，攪拌10 min，取0.2 mL稀釋液加入到100 mL的LB培養基中，28℃、150 r/min 條件下培養24 h；取上述培養液5 mL加入到100 mL的鐵離子濃度為80 mg/L，錳離子濃度為20 mg/L的PYCM改良培養基中，于28℃、150 r/min 的恒溫搖床中振蕩培養；然后每隔1周以10%（體積分數）的接種量接入到新鮮的PYCM改良培養液中，并逐漸提高鐵錳離子濃度，至培養液中鐵離子濃度達到800 mg/L，錳離子濃度達到200 mg/L，如此馴化約2個月。

取0.1 mL混合樣涂布于PYCM改良培養基固體平板上，28℃培養至有明顯單菌落。針對生長良好的單菌落，于鐵離子濃度為800 mg/L，錳離子濃度為200 mg/L 的PYCM改良培養基固體平板上進一步劃線培養，分離純化3-4次，獲得純化后的多株鐵錳氧化菌株。將菌株回接于PYCM改良培養液中，驗證是否對鐵、錳離子有氧化能力［12］。通過測定培養液中鐵錳離子含量、比較所得功能菌株的氧化能力，篩選出1株高效鐵錳氧化菌，命名為P1，并將其接種于PYCM改良斜面培養基上，培養48 h后，待長出明顯菌落后，置于4℃冰箱保存備用。

鐵/錳氧化率的計算公式如下：

式中，氧化率總鐵/總錳：培養基接種培養后Fe2+/ Mn2+的總氧化率；氧化率對照組：未接種菌株培養基中Fe2+/ Mn2+氧化率；d（Fe2+/ Mn2+）初始：培養基中初始的Fe2+/ Mn2+質量濃度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）剩余：接種培養基中剩余Fe2+/ Mn2+質量濃度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）對照剩余：對照組培養基中剩余Fe2+/ Mn2+質量濃度（mg/L）；氧化率鐵/錳：培養基中菌株生物氧化作用的Fe2+/ Mn2+氧化率。

1.2.2 高效鐵錳氧化菌的鑒定［13］

1.2.2.1 高效鐵錳氧化菌的形態觀察 將高效鐵錳氧化菌P1采用平板涂布法接種于PYCM改良固體培養基上，28℃恒溫培養24 h后觀察菌落形態。用光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態，參照《常見細菌系統鑒定手冊》對其進行生理生化鑒定［14］。

1.2.2.2 高效鐵錳氧化菌的16S rDNA序列測定 提取細菌總DNA［15］， 采用細菌的16S rDNA通用引物［12］，上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物：5'-GGTTACCTTCTTACGACTT-3'，引物由大連寶生物有限公司合成。以提取的總DNA作為模板，對該菌株的16S rDNA進行PCR擴增。反應體 系：dNTPs 4 μL（2.5 mmol/L）、10×buffer 5 μL、上游引物及下游引物各2 μL（50 μmol/L）、Ex Taq酶0.5 μL、模板DNA 2 μL，加去離子水至50 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，60℃退火90 s，72℃延伸2 min，35個循環；72℃延伸10 min［12］。PCR產物在質量分數為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，并于紫外光下觀察，然后將純化后的PCR擴增產物送上海生工測序［16］。測序結果用BLAST軟件在GenBank中進行同源性比較，采用MEGA4.0軟件構建系統發育樹［17］。

1.2.3 高效鐵錳氧化菌株生長及氧化條件的優化

1.2.3.1 單因素實驗 分別以20℃、24℃、28℃、32℃和36℃作為溫度實驗組；以5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0作為pH實驗組；以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%作為菌體接種量實驗組；以12、24、36、48、60、72和84 h作為培養時間實驗組。以上各實驗組的PYCM改良培養液均為50 mL，接種用菌懸液OD600值均調至1.0，恒溫搖床振蕩培養，以不加菌作為陰性對照，以蒸餾水作為空白對照，在培養第3天測定鐵錳氧化率及生長量OD600，分別采用過硫酸銨分光光度法和二氮雜菲分光光度法測定鐵、錳濃度［18］。每個處理設3個平行重復。

1.2.3.2 鐵錳氧化菌響應面分析實驗 根據單因素實驗結果，以溫度（A）、pH（B）、接種量（C）為自變量，以培養液中鐵離子的氧化率（Y1）和錳離子的氧化率（Y2）為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken design（BBD）模型，設計三因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和鐵錳氧化率之間的函數關系，優化鐵錳氧化的最佳環境條件。其中實驗設計因素水平見表1。二次回歸方程用以擬合自變量和響應值之間的函數關系［19］，公式如下：

式中，Y：預期響應值；A：常數；Aj：單因素直線系數；Ajj：單因素平方系數；Aij：兩個因素的交互系數。

表1 菌株P1的響應面實驗因子及水平列表

1.2.4 最佳培養及氧化條件驗證實驗 將菌株P1接種于PYCM改良培養液中，在最佳條件下培養3 d后，每12 h取樣檢測菌株的生長量OD600，同時，測定培養液中鐵錳離子的剩余濃度，計算氧化率，設置3組平行驗證實驗。

2 結果

2.1 高效鐵錳氧化菌的分離純化

經分離與純化獲得1株高效鐵錳氧化細菌，命名為P1。菌株P1菌落培養特征、革蘭氏染色照片和透射電鏡照片如圖1所示。菌株P1菌落和菌體形態特征分別見表2，生理生化指標見表3。

圖1 菌株P1菌落及菌體形態

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統發育分析

菌株P1序列已在GenBank中注冊，登錄號為KP241859。菌株P1與數據庫中8個同源性較高的細菌模式株進行比較，菌株P1的16S rDNA序列與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus有較高的序列同源性，相似性高達99.0%。其系統發育關系見圖2。目前，細菌分類學家的共識是當某兩個細菌的16S rDNA的相似性大于95%時，可將其歸為同一屬。從系統發育樹分析可知，菌株P1屬于Bacillus cereus。

表2 菌株P1形態特征

表3 菌株P1生理生化特征

圖2 菌株P1的系統發育樹

2.3 單因素實驗結果

不同因素對菌株P1生長量及鐵、錳氧化能力的影響情況，結果（圖3）顯示，當溫度為28℃時，菌株P1生長量和鐵、錳氧化率均達到最高點，生長量為1.812，鐵、錳氧化率最大值分別為79.8%和 70.7%（圖3-A）。菌株P1生長量及鐵、錳氧化率均隨pH增加先增大后減小，當pH7.0時，菌株鐵、錳氧化率達最大值，分別為79.7%和68.5%。當pH為6.5-7.5時，菌株P1生長及氧化能力最佳（圖3-B）。接種量為4%時，菌株P1生長量和鐵、錳氧化率均達到最大值，分別為1.801、81.7%和70.5%，可知4%為最佳接種量（圖3-C）。菌株P1生長量及鐵、錳氧化率隨培養時間延長呈現出先升高后下降趨勢，當培養時間為72 h，菌株P1鐵錳氧化率達到最大值，分別84.9%和68.2%（圖3-D）。綜上所述，影響菌株P1生長量和鐵、錳氧化能力的最適條件為溫度28℃、pH7.0、接種量4%、培養時間72 h。

2.4 響應面優化結果

菌株P1的響應面實驗設計方案及結果如表4所示，每個響應值實驗總共17組，其中包括5組零點實驗，以估計實驗誤差。利用Design-Expert 8.0.6軟件，對BBD模型實驗數據進行多項回歸分析后，得到二次擬合模型為：

式中，Y1為菌株P1對鐵的氧化率，Y2為菌株P1對錳的氧化率；A1、B1、C1和A2、B2、C2分別為溫度、pH、接種量的編碼值。表5是利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的菌株P1鐵、錳氧化率響應分析實驗的回歸分析結果。

由菌株P1的回歸分析結果可知，菌株鐵氧化率、錳氧化率的失擬P值均>0.05，而鐵氧化率、錳氧化率的模型P值均<0.000 1，表明方程與實際情況擬合良好。由模型預測擬合度Pred R2和模型擬合系數R2可知，鐵、錳氧化率的實驗值與預測值之間具有良好擬合度；其校正后的擬合系數表明方程模型具有很高的可信度。信噪比大于4時表明模型合理，模型的信噪比Adeq Precisior1=38.930、Adeq Precisior2=32.568， 表 明 模型合理［20］。由表5可知，在菌株P1的響應分析實驗中溫度、pH的P值均<0.000 1，說明它們對菌株P1鐵、錳氧化率具有極顯著影響，同時，在以鐵氧化率為響應值的響應分析實驗中，接種量的P值為0.002 2，表明溫度和pH對菌株鐵氧化率的影響較接種量大，從溫度（F=171.14）與pH（F=200.06）的F值可以看出pH對鐵氧化率的影響較溫度更為顯著。而在以錳氧化率為響應值的響應分析實驗中，接種量P值為0.501 7，表明接種量對菌株錳氧化率沒有顯著影響，從溫度與pH的F值可知F溫度

圖3 各因素對菌株P1生長量及氧化能力的影響

表4 菌株P1響應面實驗設計與結果

表5 菌株P1響應分析實驗方差分析結果

由上述結果可知，各因素對菌株鐵、錳氧化率的影響作用由大到小依次為：pH>溫度>接種量。

圖4為不同交互組合對菌株P1鐵錳氧化能力影響的響應曲面圖。結合圖中等高線圖和響應曲面圖能夠很好地分析交互組合對響應值的影響情況。如圖所示，當各因素固定在零水平時，較高氧化率集中在曲面的中心區域，且在此區域內均存在菌株氧化率的極值點，經軟件分析可以得到曲面的最高點，即3個因子的最優實驗點，所得菌株P1氧化鐵離子的最優實驗條件為：溫度28.3℃，pH7.18，接種量4.27%；氧化錳離子的最優實驗條件為：溫度28.9℃，pH7.27，接種量4.46 %。

經Design-Expert 8.0.6軟件分析可得菌株P1的鐵錳氧化率最優條件為：接種量4.35%，pH7.23，溫度28.54℃。

圖4 不同因素對菌株P1氧化率產生交互影響的響應曲面圖

2.5 最佳條件驗證結果

在最佳條件下進行3組平行驗證實驗，所得菌株P1的生長量及鐵錳氧化效果（圖5）顯示，通過對高效鐵錳氧化株菌生長及氧化環境的優化，使得菌株在3 d內對鐵的氧化率達到100%，而對錳的氧化率達到93%以上。

3 討論

隨著地下水中高鐵錳污染情況的日益突出，近年來關于微生物應用于處理富含鐵錳地下水的研究逐漸引起重視。國內對于鐵錳生物氧化法的研究主要集中在鐵氧化菌、錳氧化菌的篩選、鐵錳氧化去除條件以及應用方面的研究上［22］，已篩選的具有鐵氧化能力和錳氧化能力的細菌主要包括弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）［21］，節桿菌屬（Arthrobacter）［23］和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）［24］等。目前，對于同時具備鐵氧化能力和錳氧化能力的鐵錳氧化菌株的篩選、生理生化研究以及氧化條件優化等方面研究的較少［9-13］。而已篩選的具有鐵錳氧化能力的細菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）［11］和金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）［25］，其鐵氧化率均可達到90%以上，但錳氧化率均不理想，且氧化過程持續時間較長，一般為6 d左右。因此，篩選出在富含鐵錳地下水條件下，具有高效鐵錳氧化能力的細菌對高鐵錳地下水處理至關重要。

本實驗采用特異性的選擇培養基從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離篩選具有鐵錳氧化能力的菌株，同時，對菌株的鐵、錳氧化條件進行優化。常用的優化方法主要有正交實驗法和響應曲面法兩種。正交實驗法有一定局限性，它多采用線性模型，只能對一個個孤立的實驗點進行分析，無法精確找出整個區域內因素最佳組合和最大響應值［26］。而響應曲面法則采用更為合理的實驗設計方案，并同時考慮實驗隨機誤差的影響，以回歸分析方法作為函數估算工具，將多因素實驗的回歸因素和實驗結果用簡單的二次多項式模型來擬合，計算相對簡便，它能夠連續對實驗各個水平進行分析，預測模型為一個曲面，并且能夠在整個區域內獲得最佳因素組合和最優響應值［27］。因此本實驗采用響應面分析方法對菌株的鐵、錳氧化條件進行優化。研究結果表明，各因素對菌株鐵、錳氧化率的影響作用由大到小依次為：pH>溫度>接種量。經響應面優化后鐵、錳氧化率均比優化前明顯提高。

在鐵錳氧化反應體系中，主要存在兩種氧化方式，分別為化學氧化和生物氧化［23］。在本研究過程中發現，兩種氧化作用中生物氧化占主導地位。其中化學氧化隨著pH值升高氧化率表現逐漸上升趨勢。由于pH值為生物氧化中菌株氧化的主要影響因素，隨著pH值的逐漸升高，生物氧化率表現為先升高后下降的情況，在菌株最適pH7.23時，生物氧化率最高。因此隨著pH值的逐步升高，總氧化率呈現先升高后下降趨勢。

另外，后續研究還將進一步考查多株高效鐵錳氧化菌的復配并研究復配菌劑對富含鐵錳地下水的處理效果，為富含鐵錳地下水處理新方法的開發提供技術支持。

圖5 菌株P1的生長量及鐵錳氧化效果

4 結論

本實驗從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離獲得1株能夠氧化鐵錳的細菌Bacillus cereus P1，在培養溫度28℃，pH7，接種量4%的條件下，于錳含量為200 mg/L、鐵含量為800 mg/L的選擇性培養液中培養3 d后，鐵、錳氧化率分別為82%和73%。

采用響應面分析方法對菌株P1鐵、錳氧化條件進行優化，優化結果為：溫度28.54℃，pH7.23，接種量4.35%，鐵、錳氧化率最高分別可達100%和93.7%，經響應面優化后鐵、錳氧化率比優化前分別提高18%和19.3%。

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（責任編輯 李楠）

The Isolation and Identification of an Efficient Fe/Mn-oxidizing Bacterial Strain P1，and the Optimization of Its Oxidizing Conditions

FAN Xing WANG Shu-ting LI Chun-yan
（College of Resource and Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

By enrichment culture，a Fe/Mn-oxidizing bacterial strain P1 was isolated from the sludge samples of groundwater well that was rich in Fe/Mn. According to morphologic and physiological-biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis，strain P1 was identified as Bacillus cereus. Concurrently，single factor test was used to study the growth of strain P1 and its oxidation characteristics；and the response surface methodology（RSM）was employed to explore the effects of inoculation size，temperature and pH on the oxidation characteristics of strain P1 and further optimize the oxidation conditions. The results showed that the optimal oxidation conditions were temperature 28.54℃，pH 7.23，and inoculation size 4.35 %. At the optimal conditions，the removal ratios of Mn and Fe were 93 % and 100 % respectively in the selective medium containing 200 mg/L Fe and 800 mg/L Mn after strain P1 was cultured for 3 d.

Fe/Mn-oxidizing；Bacillus cereus；isolation and identification；oxidation conditions；response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.023

2015-09-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAJ12B01），東北農業大學大學生SIPT計劃創新訓練項目（201510224257）

樊星，男，研究方向：環境微生物；E-mail：good150030@sina.com

李春艷，女，博士，研究方向：環境微生物；E-mail：chunyanli@neau.edu.cn