紅提葡萄內生細菌的分離鑒定及灰霉病拮抗菌的篩選

周泠璇 劉婭

（石河子大學食品學院，石河子 832000）

紅提葡萄內生細菌的分離鑒定及灰霉病拮抗菌的篩選

周泠璇 劉婭

（石河子大學食品學院，石河子 832000）

旨在從新疆紅提葡萄的不同部位中，分離篩選出對葡萄灰霉病具有較強拮抗作用的內生細菌。采用組織分離法對紅提葡萄不同部位的內生細菌進行分離，同時進行16S rDNA序列測定及同源性分析，并采用平板對峙法和濾紙片法進行篩選，研究其對葡萄灰霉菌的抑制作用。結果表明，在分離得到的18株內生細菌中，有5株具有良好的拮抗效果，分別為NR4-1、NR5-1、NG4-1、NP1-1和PG1，抑菌率可達68.7%。

內生細菌；葡萄灰霉菌；拮抗作用；分離；鑒定

葡萄營養豐富，味道鮮美，是世界產量最大的水果之一［1，2］。新疆是我國葡萄的主產區，在地區水果種植業中占有重要地位［3］。近年來，紅提葡萄作為新疆鮮食葡萄優良品種之一，栽培面積迅速增加，發展前景廣闊［4］。然而，紅提葡萄在采后貯藏運輸期間，灰霉病病害發生普遍而且嚴重，給生產造成巨大損失，成為產業發展的一個重要障礙［5］。長久以來一直使用化學殺菌劑來抑制葡萄灰霉病，但此類傳統保鮮法易造成農藥殘留、環境污染、危害人體健康以及病原菌產生抗藥性等一系列問題，也制約了產業的發展［6，7］，而生物保鮮法為解決上述問題提供了新的契機。

植物內生菌是指存活在健康植物組織內部，而又不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群［8，9］。它們在長期的協同進化過程中，與植物形成互惠互利的共生關系［10］。植物內生細菌能產生活性物質，如抗菌肽、生物堿和幾丁質酶等［11，12］，對生物防治和穩定生態環境有一定作用。目前，內生細菌抑制病原菌的研究受到越來越多的關注，已有從駿棗［13］、辣椒［14］、小麥［15］等多種植物內分離篩選出具有抗病作用的內生細菌的報道，但內生細菌應用于果蔬采后病害防治的研究相對較少，因此分離并利用植物自身的內生細菌來控制果蔬采后病害對生態農業的發展具有重要意義。本研究采用組織分離法，從健康紅提葡萄的果梗、果皮、果肉、果籽中分離出內生細菌，探索其對葡萄灰霉菌的拮抗作用，篩選具有抑菌活性的內生細菌，從而為葡萄灰霉病的生物防治提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紅提葡萄（Red Grape）采自新疆省石河子143團葡萄園，封存于封口袋中，帶回實驗室進行內生細菌的分離。

1.1.2 病原菌 葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）由北京市農林科學院提供。

1.1.3 培養基 NA培養基［16］的分離純化培養：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.2；PDA培養基［17］：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

1.2 方法

1.2.1 紅提葡萄內生細菌的分離純化 取新鮮、完整、無病害的紅提葡萄，用自來水將表面沖洗干凈。常規無菌操作下，用75%的乙醇溶液浸泡3 min，并用無菌水沖洗4次，再用10%的次氯酸鈉溶液浸泡15-30 s，無菌水沖洗4次，之后用無菌濾紙擦干［18］。取最后一遍沖洗的無菌水做空白對照實驗，涂布NA于29℃下靜置培養7 d，若培養皿中無菌落出現，則證明消毒徹底。

將表面消毒后的紅提葡萄果實用無菌刀片切開，用鑷子撕取果皮、果肉并將果蒂、果籽切開緊貼NA平板進行培養，29℃培養3-5 d。待組織塊周圍長出菌落后，根據菌落形態、顏色、邊緣狀態、干濕度等挑取性狀不同的菌落反復劃線純化，直至得到單菌落，斜面4℃保存備用［19］。

1.2.2 內生細菌的分類鑒定

1.2.2.1 形態特征 根據菌落特性及菌體形態大小特征，革蘭氏染色等對內生細菌進行初步鑒定［20］。

1.2.2.2 16S rDNA序列測定及同源性比對 內生細菌DNA的提取采用常規CTAB法［21］。采用細菌通用引物 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'） 擴增16S rDNA基因序列。PCR反應體系為：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、模板2 μL、Taq DNA 聚合酶1 μL、引物各1 μL，補充去離子水至50 μL。反應條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，48℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環；72℃ 10 min。PCR產物用1%凝膠電泳進行分析后送北京市理化分析測試中心進行測序。

獲得各菌株序列后，與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比對分析，尋找具有較高同源性的16S rDNA序列。并利用MEGA 4.0軟件進行系統發育分析，構建系統發育樹。

1.2.3 內生細菌對葡萄灰霉菌拮抗作用的測定

1.2.3.1 初篩 采用平板對峙法［22］進行初篩，將分離得到的內生細菌菌株在NA平板上活化1 d后，用接種環挑取一環在PDA平板中央劃線，并將供試葡萄灰霉菌菌餅（直徑6 mm）分別接種在平板兩側，接種點具平板中心3 cm。同時以單獨接種灰霉菌菌餅的平板為對照，每處理做3次重復，置于25℃培養7 d，觀察菌落直徑，從中篩選出抑菌活性強的拮抗菌進行復篩。

1.2.3.2 復篩 采用濾紙片法［23］進行復篩。將初篩出的拮抗菌活化并擴大培養制成106CFU/mL的菌懸液待用。將葡萄灰霉菌菌餅（直徑6 mm）放于PDA平板中央，然后在平板上接入4個沾有內生菌發酵原液的圓濾紙片，并以沾有無菌水的濾紙片為對照。接種點具平板中心3 cm，每種處理均做3次重復。置于25℃培養7 d后，測量菌落直徑。

病原菌抑菌效果用抑菌率衡量，抑菌率（%）=［1-（處理菌落直徑/對照菌落直徑）］×100%。

2 結果

2.1 內生細菌的分離純化結果

經7 d觀察，最后一次清洗水涂布的NA平板中并未有任何菌體生長，證明表面消毒徹底，NA平板中分離得到微生物為紅提葡萄內生細菌。

通過組織分離法，從紅提葡萄中共分離得到18株內生細菌，不同組織部分分離獲得的內生細菌種類不同，且分離頻率不同。其中果梗中分離出6株（33%），果肉中分離出6株（33%），果皮中分離出5株（28%），果籽中分離出1株（6%）（表1）。雖然分離數量有限，但在一定程度上反映了紅提葡萄中內生菌的多樣性。

2.2 內生細菌的分類鑒定結果

2.2.1 內生細菌的形態特征 將分離得到的18株內生細菌在NA固體平板上29℃培養1 d，根據性狀、顏色、透明度等菌落形態進行觀察，并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態。菌株的形態學鑒定結果（表2）顯示，篩選出的18株內生細菌經革蘭氏染色后，除PG1外均呈革蘭氏陽性，菌株均為桿狀、產芽孢。

2.2.216 S rDNA序列測定及系統發育分析 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取紅提內生細菌基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，其中大部分PCR產物條帶清晰且單一，大小均約為1.5 kb，與預期目標大小一致（圖1）。

表1 紅提葡萄內生細菌的分離

表2 紅提葡萄內生細菌的形態特征

將所測得的16S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中，用BLAST 進行相關序列的比對，結果（表3）表明菌株16S rDNA序列與已知序列的同源性均達到98%以上。同時從數據庫獲得相關屬、相關種的16S rRNA基因序列，構建系統發育樹（圖2）。

通過16S rDNA序列比對分析結果和構建的系統發育樹表明，分離得到的18株內生細菌均為芽孢桿菌屬。其中枯草芽孢桿菌10株（NP2-2、NG1-1、NZ3-1、NR1-1、NR4-1、NR4-2、NR5-1、PP9、PG2和PG6），高溫芽孢桿菌3株（NP1-1、NG4-1和PG10），特基拉芽孢桿菌2株（NR2-1和NR3-1），短小芽孢桿菌1株（NP1-2），地衣芽孢桿菌1株（NP2-1），嗜熱溶胞土芽孢桿菌1株（PG1）?？莶菅挎邨U菌類為優勢類群，占總數的55.6%。

2.3 內生拮抗菌的篩選結果

2.3.1 初篩結果 采用平板對峙法對分離得到的18株內生細菌進行拮抗篩選，初篩得到8株內生細菌對葡萄灰霉菌有不同程度的拮抗作用（圖3），分別為NR3-1、NR4-1、NR5-1、NP1-1、NP2-2、NG4-1、PG1和PP9，占所分離菌株的44.4%。將初篩得到的8株菌進行復篩實驗。

圖1 部分菌株的16S rDNA基因擴增產物電泳圖譜

表3 紅提葡萄內生細菌分離鑒定結果

2.3.2 復篩結果 采用濾紙片法對初篩得到的8株內生細菌進行復篩實驗，其中5株內生細菌對葡萄灰霉菌有較好的拮抗作用（表4），占所分離菌株的27.8%。其中，2株分離自葡萄果梗，2株分離自葡萄果肉，1株分離自葡萄果皮。NR4-1對葡萄灰霉菌抑菌效果最強，抑菌率可達68.7%。

3 討論

圖2 基于16S rDNA序列構建的紅提內生細菌系統發育樹

圖3 部分內生細菌對葡萄灰霉病病原菌的拮抗效果

表45 株內生細菌對葡萄灰霉菌的抑菌效果

葡萄灰霉病是由葡萄灰霉菌引起的一種世界性病害，其病菌具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高的特點，多發生于葡萄貯藏運輸期間，引起果實腐爛，損失嚴重。目前對葡萄灰霉病的防治仍以化學防治為主，包括多菌靈、速克靈、撲海因等化學藥劑的使用仍是抑制病害的主要手段，但由于藥劑的連續使用，病菌的抗藥性產生迅速，使防效不斷下降，同時易造成農產品和環境的嚴重污染，危害人體健康［21］。為了減少化學殺菌劑的使用，確保果實的安全性，生物防治日益成為灰霉病控制中一條重要而有效的途徑。作為重要生防微生物之一的內生細菌，可以通過提高植物抗病性、與病原菌競爭生態位或產生拮抗物質等發揮防病功效，且內生細菌存在于植物體內不易受到外界環境條件的影響，可以較長時間發揮生物學作用，因此具有防治果蔬采后病害的優勢［22］。目前用于防治灰霉菌的生防內生菌種類很多，芽孢桿菌產生的芽孢耐熱抗逆，具有突出的優勢，在灰霉菌的防治中使用次數較多。其中主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等。本實驗從紅提葡萄中分離出18株內生細菌，均為芽孢桿菌，并將其用于葡萄灰霉病的生物防治中，其中5株內生細菌對病菌具有較好的拮抗效果，抑菌率最高可達68.7%。本研究所分離篩選的內生細菌是在體外條件下對病原菌進行的拮抗實驗，但其在活體上對病原菌的抑制能力是否和體外一致，能否對試驗以外的病原菌有抑菌作用，能否增加葡萄的抗病性，還需進一步研究驗證。

4 結論

本研究采用組織分離法從健康的紅提葡萄中分離得到18株內生細菌，經形態鑒定和分子生物學鑒定，均為芽孢桿菌屬。其中5株對葡萄灰霉菌具有較好的拮抗作用，分別為枯草芽孢桿菌、高溫芽孢桿菌和嗜熱溶胞土芽孢桿菌。NR4-1對葡萄灰霉菌的生長抑制作用尤其明顯，抑菌率達68.7%，具有潛在開發價值。

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（責任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of Endophytic Bacteria in Red Grape，and Screening of Antagonistic Bacteria Against Botrytis cinerea

ZHOU Ling-xuan LIU Ya
（College of Food Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000）

This experiment aims to separate the endophytic bacteria，which have the strongly antagonistic effect on Botrytis cinerea，from different parts of red grape in Xinjiang. The tissue isolation was adopted to separate the endophytic bacteria from different parts of red grape，and concurrently 16S rDNA sequence determination and homology analysis were carried out. Meanwhile，the antagonistic effect of endophytic bacteria on B. cinerea was analyzed by confrontation culture method and disc diffusion assay method. The results showed that 5 of 18 strains of endophytic bacteria had solid antagonistic effect，they were NR4-1，NR5-1，NG4-1，NP1-1，and PG1 respectively，and the bacteriostasis rate reached 68.7%.

endophytic bacteria；Botrytis cinerea；antagonism；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.024

2015-10-08

國家自然科學基金項目（31460031），兵團博士資金專項（2014BB006）

周泠璇，女，碩士研究生，研究方向：果蔬加工與貯藏；E-mail：1427168798@qq.com

劉婭，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術；E-mail：L68274609@163.com