Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因無痕敲除方法的建立

毛靈琪 李存治 閆達中

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430023）

Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因無痕敲除方法的建立

毛靈琪 李存治 閆達中

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430023）

旨在建立一種適合環己胺降解菌NyZ12基因無痕敲除的可靠方法。通過overlapping PCR技術將目的基因上下游同源臂融合并克隆到自殺載體pEX18km上，將重組質粒轉化到大腸桿菌S17 pir中，再通過接合轉移到假單胞菌NyZ12菌株內，經pEX18km質粒上sacB基因的反向篩選得到突變株并通過PCR方法和測序鑒定。結果顯示，成功構建了假單胞菌NyZ12菌株orf4637的基因突變株（NyZ12Δ4637）。通過自殺載體同源重組可以成功獲得敲除的無痕突變株，且突變株基因組上沒有任何抗性篩選標記殘留，為環己胺降解菌NyZ12基因功能研究提供了可靠的基因敲除技術。

基因敲除；自殺載體；同源重組；結合轉移

環己胺（cyclohexylamine，化學式C6H13N）又稱六氫苯胺，是一種重要的精細化工中間體，用于生產金屬緩蝕劑、殺菌殺蟲劑、橡膠硫化促進劑和防老劑等。在生產和使用過程中，環己胺被釋放到環境中，可通過呼吸和皮膚進入人體，實驗已證實該化合物有致癌性［1］。由于環己胺在工業生產上的廣泛應用和對人體的明顯危害性，研究對環己胺有降解作用的微生物并了解其分子機制，是消除環己胺對環境污染和殘留的有效途徑之一。

目前報道的以環己胺為碳氮源生長的純培養物僅有兩株，一株是Iwaki 等［2］分離篩選到的革蘭氏陽性菌Brevibacterium oxydans IH-35A，另一株是由中國科學院武漢病毒研究所周寧一［3］研究組分離的革蘭氏陰性菌Pseudomonas plecoglossicida NyZ12。

NyZ12是一株能夠利用環己胺作為唯一碳源、氮源生長的革蘭氏陰性菌株，根據其16S rRNA基因序列分析為假單胞菌屬，鑒定為變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida NyZ12。這與Iwaki等分離篩選到能降解環己胺的革蘭氏陽性短桿菌Brevibacterium oxydans IH-35A不同，也是目前為止國內第一次報道能降解環己胺的細菌。

本實驗室對該菌株進行全基因組測序，獲得全基因組信息［4］。通過對比分析，預測orf4637基因可能與環己胺降解過程有關。研究基因功能的重要方法之一是構建基因的突變體來檢測其表型的變化，以推測某個基因在生長過程中起到何種作用。其中最直接的方法是將目的基因敲除，這樣可以保證被研究的基因完全失活［5］。因此，為了進一步研究基因orf4637的功能，本研究采用無痕敲除技術構建Δ4637基因敲除體系。通過overlapping PCR技術［6］將目的基因上下游同源臂融合并克隆到自殺載體上，再將構建的敲除載體轉移至受體菌，利用同源重組原理取代基因組上序列相同或非常相近的基因并使后者完全喪失功能［7］。旨在為后期對敲除突變體NyZ12Δ4637進行表型研究，確定其在生長中是否起關鍵作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 假單胞菌NyZ12（AmpR）；E.coli S17 pir菌株（StrR）；pGEM-T Easy載體（AmpR）；自殺質粒pEX18km（KanR），所用抗生素濃度為氨芐青霉素Amp（100 g/mL），鏈霉素Str（10 g/L），卡那霉素Kan（50 g/L）。

1.1.2 主要試劑 5×TransStart FastPfu buffer、TransStart FastPfu DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs、限制性內切酶EcoR I和Sal I，T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司；質?？焖偬崛≡噭┖?、PCR產物凝膠回收試劑盒（離心柱型）、基因組提取試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司。

CCMB80溶 液：KAc（1 mol/L pH8.0）1 mL，0.891 g NaCl，Glycerol 10 mL，MnCl2·4H2O（1 mol/L） 1 mL，MgCl2·6H2O（1 mol/L）1 mL，定容至100 mL，過濾除菌，冰上儲存備用。

LB培養基：NaCl 1 g，Tryptone 1 g，Yeast Extract 0.5 g，加水定容至100 mL，121℃下高溫滅菌20 min。

環己胺無機鹽培養基：KH2PO41.5 g，Na2HPO4· 12H2O 3.8 g，定容至1 L，121℃高溫滅菌；再依次加入高溫滅菌的10 mL 1 g/L CaCl2·2H2O；10 mL過濾除菌的5 g/L MgSO4·7H2O、0.2 g/L MnSO4·4H2O及0.5 g/L FeSO4·7H2O的混合體系，10 mL過濾除菌1 mol/L的環己胺鹽酸鹽溶液（pH7）。

RGMC：1% Tryptone；0.1% Yeast extract；0.8% NaCl；0.1% glucose；5 mmol/L MgCl2；5 mmol/L CaCl2。其他生化試劑均從國藥集團化學試劑有限公司購買的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 同源臂擴增 設計兩對引物分別擴增orf4637基因上游約700 bp及下游約900 bp大小同源臂，引物序列見表1。以環己胺降解菌NyZ12基因組DNA作為模板，引物對分別為P1/P2和P3/P4進行PCR反應，PCR體系如下：模板0.3 μL，FastPfu酶1 μL，5×FastPfu buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，加無菌去離子水至50 μL。擴增程序為：98℃ 2 min，98℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，30個循環；72℃ 5 min。凝膠電泳回收PCR產物。

表1 用于 4637突變株構建及鑒定的引物

1.2.2 融合PCR反應 純化后的同源臂片段1∶1混合，將混合DNA片段作為模板進行融合PCR，引物對為P1/P4。PCR體系和擴增程序同上，延伸時間延長至1 min，將純化PCR產物加“A”后克隆到pGEM-T Easy載體上，酶切鑒定連接正確大小片段的克隆并測序。

1.2.3 缺失突變載體的構建 分別以EcoR I和Sal I對pEX18km質粒和連有目的片段的pGEM-T Easy載體進行雙酶切并經過凝膠電泳回收。將酶切后的質粒和目的片段按適當的比例混合，加入T4連接酶在16℃連接過夜，再將連接產物轉化到E.coli S17 pir感受態細胞中，轉化產物在37℃，180 r/min的LB培養基中活化1 h后，取100 μL涂布于LB平板上（StrR，KanR），37℃培養至出現單菌落。通過酶切鑒定篩選出含有融合片段的重組質粒。

1.2.4 結合轉移［8］和單交換 將含重組質粒的E.coil S17 pir接種在LB培養基中，環己胺降解菌NyZ12接種在無機鹽培養基中。分別在37℃和28℃，170 r/min培養至OD600=0.5-0.8。隨后以供體菌（含有重組質粒E.coil S17 pir）與受體菌（NyZ12）1∶2和1∶5的比例混合菌液，6 000 r/min離心30 s收集菌體，用100 μL RGMC將菌體洗滌兩遍，最后50 μL重新懸浮并滴加在濾膜上。待菌液被濾膜充分吸收后，將其案貼在RGMC平板上，28℃培養8-12 h。之后用100 μL無菌水洗滌濾膜，洗下的菌液涂布在含有氨芐青霉素和卡那霉素的雙抗LB平板上，28℃培養至長出單克隆菌落。根據抗性篩選和PCR鑒定，找到發生單交換菌株。

1.2.5 雙交換 挑單交換菌株接種于LB培養基中（AmpR），28℃，170 r/min多次傳代培養。傳至第4代將菌液稀釋100倍后取100 μL涂布于10%蔗糖的LB平板上，28℃培養至出現單菌落。挑取單克隆接種于含有Amp的LB培養基中培養，再將過夜培養的菌液取4 μL分別接種于含有Amp或者含有Kan和Amp雙抗LB培養基中，28℃培養。挑選能在Amp培養基中生長但不能在雙抗培養基中生長的單克隆進行PCR鑒定，鑒定引物P1/P4和E1/E2。

將本實驗中突變載體的構建和交換過程分別總結為圖1、圖2。

1.2.6 測序驗證 煮沸法［9］提取敲除菌的基因組，并以敲除菌基因組DNA作為模板，引物對分別為P1/E2進行PCR反應，PCR體系如下：模板4 μL，FastPfu酶1 μL，5×FastPfu buffer 10 μL，引物各1 μL，加無菌去離子水至50 μL。擴增程序為：98℃ 2 min；98℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 5 min。凝膠電泳回收PCR產物并送至生工測序部測序。

圖1 Δ4637突變載體構建步驟流程圖

圖2 單交換和雙交換過程

1.2.7 生長實驗 將敲除菌與野生菌按0.5%的接種量接種于裝有50 mL無機鹽培養基的三角瓶（250 mL）中，從12 h開始取樣，然后每隔1 h測定菌液OD值，繪制敲除菌與野生菌的生長曲線，比較生長狀況。

2 結果

2.1 同源臂與融合PCR

擴增引物對P1/P2擴增orf4637上游同源臂（約663 bp），引物對P3/P4擴增orf4637下游同源臂（約863 bp），成功融合的片段大小為1 526 bp。1%瓊脂糖電泳結果（圖3、圖4）顯示，PCR產物大小與預期相符，通過凝膠電泳回收得到高純度的目的片段。

圖3 PCR擴增同源臂

圖4 PCR擴增融合片段產物

2.2 重組質粒的構建

將融合片段加A后連接到pGEM-T Easy載體上，抽取質粒并酶切鑒定，確定目的片段連接T載體上的陽性克隆測序。提取質粒pEX18km并用EcoR I和Sal I進行酶切，酶切后的DNA片段進行瓊指糖電泳，結果（圖5）顯示，大小約為 6 100 bp，與標準序列大小相符。再用EcoR I和Sal I對連接目的片段的T載體片段進行雙酶切，將兩個片段分別回收后連接構建重組質粒pEx18km-△4637，轉化至E.coli S17 pir菌株中，抽取質粒酶切鑒定，鑒定結果見圖6。

2.3 單交換突變體的鑒定

E.coli S17 pir與環己胺降解菌通過微孔濾膜進行結合轉移的效率比較高，重復性好。一般能在卡那霉素和氨芐青霉素抗性平板上生長的單克隆都是發生了單交換的陽性重組克隆。再挑取單菌落進一步鑒定，分別用擴目的基因orf4637的引物對E1/E2和基因敲除引物對P1/P4進行PCR鑒定。用引物E1/E2擴增有1 600 bp和120 bp左右兩條DNA片段（圖7，1、2泳道），以P1/P4擴增有3 000 bp和1 600 bp左右兩條片段（圖8，2、3泳道）的克隆就是發生單交換的突變株。

圖5 pEx18km酶切后電泳圖

圖6 重組質粒pEx18km-△4637酶切鑒定圖

2.4 雙交換與突變株鑒定

單交換菌株在LB培養基中傳4代，稀釋后涂布于含有Amp和10%蔗糖的LB平板上。由于自殺質粒pEx18km上sacB基因突變率高，在平板上長出的單克隆也可能是單交換菌。但是雙交換菌不具備Kan抗性，單交換菌具有Kan抗性，所以利用抗性篩選，找到可能的雙交換突變體。再以該菌基因組為模板，分別用擴目的基因orf4637的引物對E1/E2和基因敲除引物對P1/P4進行PCR鑒定，鑒定結果如圖9和圖10所示。以引物E1/E2擴增只有120 bp大小片段（圖9，1泳道），而外側引物對P1/P4擴增只有1 600 bp左右片段的克隆即為發生雙交換的陽性克隆，相對于單交換，無3 000 bp左右的擴增產物（圖10，1泳道），其擴增產物比以野生株為模板的擴增產物小了約1 400 bp，即缺失了基因編碼區。

圖7 E1/E2引物對鑒定單交換

圖8 P1/P4引物對鑒定單交換

圖9 E1/E2引物對鑒定雙交換

圖10 P1/P4引物對鑒定雙交換

2.5 敲除菌株測序結果

煮沸法提取敲除菌株基因組并利用引物P1/E2擴增缺失區得到約750 bp大小片段，如圖11所示。

將目的片段凝膠電泳回收并送至生工測序部測序，結果如圖12所示。

圖11P1/E2引物擴敲除片段

由于這段序列靠近測序3'端，有幾個堿基突變和缺失，可能是測序誤差。這段序列已經跨過敲除區域，可以從兩段序列的對比發現orf4637基因中間缺失，說明的確發生了雙交換，orf4637成功敲除。

2.6 敲除菌生長實驗

通過對敲除菌的生長實驗的研究，繪制了敲除菌與野生菌的生長曲線（圖13），比較發現敲除orf4637突變體相對野生型在環己胺的無機鹽培養基中的生長變慢，但不是很明顯。

3 討論

目前國際上對環己胺的微生物降解研究并不多，微生物代謝環己胺的分子機理尚未揭示，因此以環己胺降解菌NyZ12為實驗對象，構建一種可行的無痕敲除體系，成功敲除野生菌中的目的基因，對后續研究該菌的環己胺降解分子機制至關重要。利用同源重組技術敲除目的基因是目前研究基因功能最常用的定點突變手段，無痕敲除的主要優勢是不需要在同源序列中插入抗性標記基因，這樣不僅簡化了敲除載體的構建，而且減少了插入抗生素基因產生極性效應對菌株生長產生的不良影響。同時構建敲除載體時，SacB 基因的引入使得無痕敲除效率大大提高。SacB基因來源于枯草芽孢桿菌，編碼分泌性的蔗糖-6-果糖基轉移酶，該酶催化蔗糖的水解和果聚糖的合成。在革蘭氏陰性菌中，在有蔗糖存在的情況下，基因的表達對細菌來說是致死性的［10］。

圖12 測序鑒定雙交換突變體

圖13 敲除菌的生長曲線

自殺載體pEx18km［11］不僅有反向篩選基因sacB還有Kan標記抗性，因此發生第一次交換后，將突變株涂布于含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，因為野生菌本身具有Amp抗性而E.coli S17不含Amp抗性，因此能在平板上生長的單克隆，應該是整合了pEx18km的環己胺降解菌，也就是發生了單交換，再利用PCR方法確定，可以找到發生單交換的陽性克隆。此方法大大加快了構建缺失株的步伐，成為整個構建無痕突變株過程的關鍵步驟。再將多次傳代的單交換菌株，涂布于高蔗糖濃度的LB平板。利用蔗糖的選擇性壓力和細菌染色體復制過程中發生的自由重組去除載體序列，產生無標記突變株［12，13］。在整合了pEx18km的環己胺降解菌中只有發生第二次交換的突變株才能在含有蔗糖的培養基中生長?？股乜剐院蛃acB基因表達可作為正和負選擇標記，但是自發的抗生素抗性、高異常重組率和基因突變可能會導致較高的假陽性，所以最后應對大量突變株進行鑒定［14］。

我們完成了環己胺降解菌NyZ12的基因組測序，預測基因組有5個胺氧化酶基因，最直接驗證基因功能的方法是克隆表達基因，測定是否有酶活力。初步實驗結果表明orf4637對底物環己胺有酶活力。通過基因敲除，觀察突變體的生長情況，從另一個角度回答orf4637是否參與環己胺的代謝。對NyZ12Δ4637敲除菌株進行了生長實驗，與野生菌對比，發現基本生長情況變化不明顯，所以推斷環己胺代謝途徑中催化其第一步的環己胺氧化酶可能有多個，orf4637不是主效基因。這為后續逐一敲除其他胺氧化酶基因，研究突變體的表型奠定了基礎。

4 結論

本研究選擇可能與環己胺降解有關的orf4637作為目的基因，選用自殺質粒pEx18km作為載體，建立了成熟的環己胺降解菌NyZ12基因無痕敲除方法，成功構建了假單胞菌NyZ12Δ4637基因突變株。

［1］Bopp BA, Sonders RC, Kesterson JW. Toxicological aspects of cyclamate and cyclohexylamine［J］. Crit Rev Toxicol, 1986, 16：213-306.

［2］Iwaki H, Shimizu M, Tokuyama T, et al. Biodegradation of cyclohexylamine by Brevibacterium oxydans IH-35A［J］. Appl Environ Microb, 1999, 65：2232-2234.

［3］Shen Y, Yan DZ, Chi XQ, et al. Degradation of cyclohexylamine by a new isolate of Pseudomonas plecoglossicida［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2008, 24：1623-1625.

［4］Li X, Li CZ, Mao LQ, et al. Complete genome sequence of the cyclohexylamine-degrading Pseudomonas plecoglossicida NyZ12［J］. Journal of Biotechnol, 2015, 199：29-30.

［5］ 于慧敏, 馬玉超. 工業微生物代謝途徑調控的基因敲除策略［J］.微生物代謝工程, 2010, 26（9）：1199-1208.

［6］Lee J, Shin MK, Ryu DK, et al. Insertion and deletion mutagenesis by overlap extension PCR［J］. Methods in Molecular Biology, 2010, 634：137-146.

［7］黃勇. 細菌基因突變的策略及應用術［J］. 微生物學通報, 2007, 34（1）：169-172.

［8］Simon RU, Priefer U, Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering：transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria［J］. Nat Biotech, 1983, 1：784-791.

［9］張志鴻, 甘蓓, 譚強來, 等. 基于不同靶基因的熒光定量PCR快速檢測蠟樣芽孢桿菌的研究［J］. 食品工業科技, 2013, 23（34）：160-163.

［10］Hu F, Jiang X, Zhang JJ, et al. Construction of an engineered strain capable of degrading two isomeric nitrophenols via a sacB - and gfp -based markerless integration system［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98（10）：4749-4756.

［11］Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, Kutchma AJ, et al. A broadhost-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences：application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants［J］. Gene, 1998, 212（1）：77-86.

［12］Heng C, Chen ZJ, et al. Expression and secretion of an acid-stable α -amylase gene in Bacillus Subtilis by SacB promoter and signal peptide［J］. Biotechnol Lett, 2005, 27（21）：1731-1737.

［13］Sun XY, Yang DD, Wang YY, et al. Development of a markerless gene deletion system for Streptococcus zooepidemicus：functional characterization of hyaluronan synthase gene［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97：8629-8636.

［14］Zhou QM, Fan DJ, Xie JB, et al. A method for generating precise gene deletions and insertions in Escherichia coli［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2010, 26：1323-1329.

（責任編輯 李楠）

A Method for Constructing Unmarked Deletion Mutants of Pseudomonas plecoglossicida NyZ12

MAO Ling-qi LI Cun-zhi YAN Da-zhong
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023）

This study aims to establish a practical method for an unmarked gene knockout of Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 that degrades cyclohexylamine，which is significant for further studying the molecular mechanism of it degrading cyclohexylamine. The upstream and downstream flanking DNA fragments of the target gene were fused by overlapping PCR，and then cloned into the suicide vector pEx18km. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain S17 pir and then transferred into NyZ12 by conjugation. The mutants by inverse screening sacB gene in pEx18km was identified by PCR and sequencing. The mutant NyZ12Δ4637 from NyZ12 strain orf4637 were successfully constructed. In conclusion，the unmarked gene-knockout mutant was acquired using homologous recombination of suicide vector，and there was no resistance residual of screening marker on the genome of the mutant. This study provides a reliable gene-knockout technology for investigating the genetic functions of NyZ12.

gene knockout；suicide vector；homologous recombination；conjugative transfer

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.027

2015-08-25

國家自然科學基金項目（31270112），微生物代謝國家重點實驗室（上海交通大學）開放課題（MMLKF14-06）

毛靈琪，女，碩士研究生，研究方向：微生物學；E-mail：qzjsmlq@163.com

閆達中，男，博士，副教授，研究方向：微生物學；E-mail：yandz6808@163.com