一個融合魏斯氏菌隱蔽質粒的序列分析

王海娟戴雨珂蘇森森王英潘渠

（1. 成都醫學院病原生物學教研室，成都 610500；2. 成都醫學院公共衛生系，成都 610500；3. 成都軍區總醫院腎內科，成都 610500）

一個融合魏斯氏菌隱蔽質粒的序列分析

王海娟1戴雨珂2蘇森森1王英3潘渠1

（1. 成都醫學院病原生物學教研室，成都 610500；2. 成都醫學院公共衛生系，成都 610500；3. 成都軍區總醫院腎內科，成都 610500）

從融合魏斯氏菌（Weissella confusa QJ012）中發現一個隱蔽質粒（pQJ012），測序結果顯示該質粒大小為1 489 bp，堿基G+C含量為42.8%。BLAST結果顯示該質粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分別為93%、92%。ORF1編碼一個282個氨基酸殘基的復制蛋白（Rep），其氨基酸序列與質粒pJY33和pKLCA的同源性分別為91%、85%。根據復制蛋白、dso和sso的序列特征，推定pQJ012的復制方式為滾環復制，是滾環復制pT181家族成員。質粒pQJ012可能構建為良好的表達載體。

融合魏斯氏菌；隱蔽質粒；序列分析；復制蛋白

魏斯氏菌（Weissella）屬于乳酸菌（Lactic acid bacteria），近年來，魏斯氏菌在微生物學、醫藥學及發酵、工業、食品加工等方面的應用開始受到研究者的關注。魏斯氏菌作為益生菌的一員，對胃腸道健康有一定的促進作用［1］。魏斯氏菌具有β-葡糖苷酶活性［2］，較好的抗真菌性［3］，能促進乳桿菌（Lactobacillus）的生長［4］。魏斯氏菌產生的乳酸和各種胞外多糖，對食品的風味感官有一定的影響［5］。同時，相關魏斯氏菌新種的發現，證實其在食品的防腐方面也有著較大的應用潛能［6］。魏斯氏菌益生性質的廣泛應用有待于其分子與基因水平更深層次的研究。

尋找新的質粒，構建轉化率高的表達載體是促進魏斯氏菌基因工程發展的方法之一，也是魏斯氏菌走向實踐應用的有效途徑。2007年Park等［7］首次從韓國泡菜分離的食竇魏斯氏菌（W. cibaria）中鑒定出3個質粒，pKLCA、pKLCB和pKLCC。國內學者在對發酵辣白菜的研究中，從食竇魏斯氏菌中分離出2個質粒，其大小分別為3 000 bp和8 000 bp［8］。Kim等［9］從韓國泡菜分離得到的食竇魏斯氏菌（W. cibaria KLC140）中發現6種不同的質粒，其中最小的質粒長度為2 126 bp，命名為pKW2124，該質粒的復制方式為θ復制。將pKW2124與slpA和 gfp 的融合基因連接，導入載體pUC19，形成一個8.6 kb的表面展示載體pKWCSLGFP。隨后，相關學者把pKW2124的復制起始點（ori）、核糖體結合位點（RBS）、復制蛋白（rep）基因插入克隆載體pUC19，形成載體pKUCm1。實驗發現，pKUCm1宿主范圍廣泛，包括魏斯氏菌屬（Weissella），乳球菌屬（Lactococcus），明串珠菌屬（Leuconostoc），乳桿菌屬（Lactobacillus），同時，含有啟動子的β-半乳糖苷酶基因被成功插入載體pKUCm1，形成可應用于藍白斑篩選的質粒pKUGal［7］。目前，已發現的魏斯氏菌質粒還非常有限，而以上已被發現質粒中除pKW2124的復制方式被證實為θ復制外，其余質粒復制方式都不明確。新質粒的發現對魏斯氏菌分子生物學及遺傳學的研究具有重要意義。

本研究從融合魏斯氏菌QJ012菌株中分離出一個隱蔽性質粒，并對該質粒進行測序和分析，旨在構建為良好的表達載體。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pUC57為廣州艾基有限生物公司提供，T載體試劑盒、革蘭陽性菌基因組提取試劑盒和PCR（Ex Taq）購自大連寶生物公司（TaKaRa）。質粒提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，膠回收試劑盒購自Omega公司（Bio-Tek USA），限制性內切酶購自Thermo公司。培養條件：MRS培養基［10］37℃靜置培養18-48 h。

1.2 方法

1.2.1 魏斯氏菌的分離鑒定 菌株QJ012樣本來自湖南泡菜。將泡菜樣品在MRS培養基上劃線培養，挑取生長的單菌落進行革蘭染色觀察。魏斯氏菌應該為紫紅色的短桿狀細菌。培養篩選出的革蘭陽性菌，用革蘭陽性菌基因組提取試劑盒提取基因組。根據細菌16S rDNA基因的高度保守，利用細菌16S rDNA通用引物對（正義：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反義：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'），擴增QJ012菌株的16S rDNA基因。PCR擴增片段通過膠回收純化，然后進行A-T克隆，最后送到成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.2.2 生化鑒定 過氧化氫酶試驗采用傳統方法進行。葡萄糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖的發酵產酸試驗使用細菌微量生化管進行，培養方式為37℃靜置培養［11］。

1.2.3 質粒提取與測序 離心收集融合魏斯氏菌QJ012菌體，用質粒提取試劑盒提取質粒pQJ012，膠回收試劑盒分離純化質粒條帶。將分離純化得到的質粒委托廣州艾基生物有限公司進行測序，方法為物理破碎后導入載體pUC57，然后測序。

1.2.4 酶切鑒定 測序后通過分析pQJ012具有的酶切位點，使用HindⅢ和Nhe I 對質粒提取液進行雙酶切，通過分析酶切前后條帶大小，鑒定其能否被相應限制性內切酶切開。

1.2.5 質粒相似性鑒定及序列注釋 利用序列比對工具BLAST，在GenBank數據庫中比對融合魏斯氏菌質粒pQJ012的測序結果，檢索該質粒與已知魏斯氏菌質粒的同源性。利用NCBI網站上的ORF Finder（Open reading frame finder）尋找該質?？赡艽嬖诘拈_放閱讀框（ORF）。利用DNAMAN（V6）軟件標注該質粒的重要酶切位點。

1.2.6 復制方式推定 通過分析質粒pQJ012的Rep以及dso和sso保守序列，推導pQJ012復制方式所屬家族及其可能的復制方式。

2 結果

2.1 魏斯氏菌的分離鑒定

從樣本中分離出一株魏斯氏菌，在MRS平板培養基上，魏斯氏菌形成透明的小菌落，呈微隆起圓狀輪廓；革蘭氏染色后鏡檢發現該菌呈革蘭氏陽性，短桿狀，將其命名為QJ012。QJ012菌株的16S rDNA基因擴增片段長1 631 bp，序列比對結果表明，融合魏斯氏菌（W.confusa Inje LM S-338）的16S rDNA序列（GenBank：DQ321751.1）是與擴增片段最相似的序列，相似性為99.9%，1 569 bp中有2個堿基不同；其次是魏斯氏菌（Weissella sp. MMZ50B，GenBank：EU157913.1），相似性為99.7%，1 546 bp中有5個堿基不同。QJ012菌株的16S rDNA基因同與其最相似的融合魏斯氏菌的16S rDNA基因差異僅為0.01 %，可判斷QJ012菌株為融合魏斯氏菌。

2.2 生化試驗驗證

融合魏斯氏菌QJ012的生化試驗結果為不產生過氧化氫酶，不能利用L-阿拉伯糖，發酵葡萄糖、纖維二糖、半乳糖和麥芽糖均產酸，符合魏斯氏菌屬和融合魏斯氏菌種的生化特征。生化試驗結果符合分子鑒定的結論。

2.3 質粒提取與序列測定

融合魏斯氏菌QJ012質粒提取液電泳結果（圖1）顯示該提取液有2個條帶，分別為1.5 kb和14.5 kb，提示QJ012可能攜帶兩個質粒。將較小的條帶代表的質粒命名為pQJ012，分離純化該質粒，委托廣州艾基生物有限公司進行測序。測序后發現該質粒大小為1 489 bp，測序結果提交GenBank，登錄號為：KR973434。

2.4 酶切鑒定

通過DNAMAN軟件對pQJ012序列的酶切位點分析顯示其能被HindⅢ和Nhe I切開。兩個酶切位點相距347個堿基，雙酶切后，質粒將被切為347 bp和1 142 bp兩個線性片段。融合魏斯氏菌質粒提取液經雙酶切后電泳結果（圖1）顯示有0.3 kb、1.1 kb、1.2 kb、2 kb和13 kb共5條條帶，其中0.3 kb與1.1 kb條帶應為pQJ012被切開后產生的條帶，1.2 kb、2 kb和13 kb條帶應為14.5 kb條帶所代表質粒被切開后產生的條帶。

圖1 融合魏斯氏菌質粒pQJ012酶切鑒定電泳圖

2.5 質粒相似性鑒定及序列注釋

質粒pQJ012的G+C含量為42.8%，BLAST比對結果顯示，該質粒的核苷酸序列與食竇魏斯氏菌中已被發現的質粒pJY33（2 365 bp）、pKLCA（1 490 bp）最為相似，與pJY33（GenBank number：KF879106.1）的相似性為93%，1 454 bp中相似序列長度為1 354 bp；與pKLCA（GenBank number：AY188776.1）的相似性為92%，1 498 bp中相似序列長度為1 364 bp。目前，pJY33與pKLCA在PubMed尚無文獻可供查閱。通過ORF搜索，pQJ012有5個ORF，ORF1編碼一個282個氨基酸殘基的蛋白，從593 bp到1 441 bp，應為該質粒的復制蛋白（Rep）（圖2）；其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白。該Rep的氨基酸序列與pJY33和pKLCA的Rep氨基酸序列同源性分別為91%和85%。 該質粒沒有編碼影響菌株表型的蛋白，應歸為隱蔽質粒。

圖2 質粒pQJ012的物理圖譜

2.6 復制方式推定

滾環復制的質粒必須攜帶dso和sso位點，并編碼相關復制蛋白，根據dso和復制蛋白的不同，滾環復制的質粒至少被分為7大家族：pT181、pC194/pUB110、pE194/pLS1、pSN2、pGA1、pG13和pTX14［12］。pT181家族的復制蛋白的保守結構域是pfam02486，dso位點有三項特征：復制蛋白切開位點nic區的保守序列為TAATAG［13］；圍繞nic區有3個反向重復序列［14］；dso位點位于復制蛋白編碼區的N端。pT181家族的sso位點為ssoA，其保守序列是TAGCGA/T［13］。經過序列分析，pQJ012的復制蛋白具有保守結構域pfam02486；其dso位點具有pT181家族的三項特征（圖3-A，圖4）。pQJ012的 sso位點吻合ssoA的特征（圖3-B）。綜上，我們推定pQJ012的復制方式為滾環復制，屬于pT181家族。

圖3 質粒pQJ012 dso（A）和pQJ012 ssoA（B）序列比對圖

圖4 質粒pQJ012復制起始點示意圖

3 討論

魏斯氏菌屬于益生菌，能產生β-葡糖苷酶、胞外多糖，具有食品防腐性能等優勢，在醫藥與食品加工方面具有極大的開發潛力和商業價值。魏斯氏菌質粒的研究是在分子基因水平改造魏斯氏菌的基礎，新質粒的發現，對于微生物的遺傳學研究和構建具有自主知識產權的表達載體都具有重要意義。目前，魏斯氏菌質粒的研究還非常有限，魏斯氏菌中已被發現并對其序列進行了分析研究的質粒有pKLCA、pKLCB、pKLCC［7］和pKW2124［9］。以上被發現的質粒中，只有pKW2124的復制方式已被驗證為θ復制，同時pKW2124已被成功構建為表達載體［9］，而且以上已被分析的魏斯氏菌中的質粒均分離自食竇魏斯氏菌。本研究中pQJ012為融合魏斯氏菌中首次被分離報道的質粒，pQJ012同食竇魏斯氏菌中已發現的質粒pJY33（2 365 bp）和pKLCA（1 490 bp）最相似。這兩個質粒在GenBank中有供查詢的序列，但在PubMed尚無文獻可供直接查閱。

分析pQJ012、pJY33和pKLCA的基本元件，即復制起點和復制蛋白，發現他們都屬于滾環復制pT181家族。pQJ012、pJY33與pKLCA的質粒復制雙鏈啟動位點dso都符合滾環復制pT181家族的特征，nic區都含有保守序列TAATAG，圍繞nic區都有3個反向重復序列。只是3個質粒的反向重復序列的堿基序列雖然相同，但間距有所不同。3個質粒的質粒復制單鏈啟動位點sso都是ssoA。3個質粒的推定復制蛋白（Rep）的氨基酸序列同源性很高，都有滾環復制蛋白保守結構域pfam02486。

4 結論

本研究首次從融合魏斯氏菌中發現一個隱蔽質粒pQJ012，其核苷酸序列同食竇魏斯氏菌中的pJY33和pKLCA的同源性分別為93%和92%。ORF1編碼復制蛋白（Rep），該復制蛋白氨基酸序列與質粒pJY33和pKLCA的同源性分別為91%和85%。推斷pQJ012的復制方式為滾環復制，屬于滾環復制pT181家族成員，質粒pQJ012可能構建為良好的表達載體。

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（責任編輯 李楠）

Complete DNA Sequence Analysis of a Cryptic Plasmid Isolated from Weissella confusa

WANG Hai-juan1DAI Yu-ke2SU Sen-sen1WANG Ying3PAN Qu1
（1. Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；2. School of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；3. Department of Kidney Disease，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610500）

A cryptic plasmid isolated from Weissella confusa QJ012，designated as pQJ012，was sequenced and characterized，and it was a 1489 bp circular molecule with a 42.8% G+C content. The result of BLAST showed that nucleotide sequence of pQJ012 was in homology with pJY33（93%）and pKLCA（92%）. ORF1 encoded a 282 amino acid residue Rep protein that was 91% identical to pJY33 and 85% identical to pKLCA in homology. Sequence analysis indicated that plasmid pQJ012 belonged to pT181 family of rolling-circle replication（RCR）. The pQJ012 may be constructed as a promising expression vector.

Weissella confuse；cryptic plasmid；sequence analysis；replication protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.029

2015-08-13

國家自然科學基金項目（31170007），四川省教育廳科技基金重點項目（14ZA0219），成都醫學院病原生物學學科建設項目（CYXK2012005）

王海娟，女，研究方向：病原生物與感染性疾病研究；E-mail：934147264@qq.com

潘渠，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：病原生物與感染性疾病研究，E-mail：ppqlove@126.com；王英，E-mail：renshicu123456@163.com