合成多肽對結核分枝桿菌的胞內抑制作用

陳吉 殷玉和 李玲玲 金浩 唐銘一 吳叢梅

（長春工業大學化學與生命科學院，長春 130012）

合成多肽對結核分枝桿菌的胞內抑制作用

陳吉 殷玉和 李玲玲 金浩 唐銘一 吳叢梅

（長春工業大學化學與生命科學院，長春 130012）

評價合成多肽對人白血病單核巨噬細胞THP-1的毒性和對結核分枝桿菌H37Rv的胞內抑菌作用。 通過多肽的不同給藥濃度，確定多肽對結核分枝桿菌的最小抑菌濃度（MIC），利用流式細胞術方法和MTT法檢測2號肽對細胞THP-1的毒性作用，同時采用CFU方法檢測其對H37Rv菌株的胞內抑菌作用。篩選的4條多肽均有抑菌作用，其中2號肽的最小抑菌濃度（MIC）最小，為200 μg/mL。2號肽與細胞THP-1作用時，濃度為1 200 μg/mL時表現出細胞毒性，與 INH細胞毒性無顯著差別。對于胞內H37Rv，2號肽抗結核作用具有時間和劑量依賴效應，隨給藥時間和劑量的增加H37Rv菌落數明顯下降。2號肽不僅對巨噬細胞THP-1的毒性小，而且具有較好的抗胞內結核分枝桿菌活性，是一種潛在的抗結核新型藥物。

合成多肽；結核桿菌；巨噬細胞；胞內抑菌

多肽通常認為是所含氨基酸數量在50-100的小分子蛋白，因為易于合成與優化組合，使其在藥物研發中表現出特定的優勢和臨床價值［1］。結核桿菌的持留性和耐藥性使抗結核病成為近年來中國所面臨的重要問題之一［2］，結核桿菌基因組測序完成后，針對結核桿菌的多肽抑制劑研究成為新的藥物研發方向［3，4］。

異檸檬酸裂解酶（ICL）是結核桿菌在人體內處于持續感染狀態時乙醛酸支路代謝中的關鍵酶，是其潛伏狀態下利用碳源所必需的［5］。本課題組前期工作即以結核桿菌ICL作為靶點篩選可以抑制細菌生長的多肽，且利用噬菌體肽庫篩選技術和分子對接技術，優化篩選出4種異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑［6］。本研究進一步檢測這4種多肽的細胞毒性和胞內抑菌作用，以期獲得潛在的抗結核新型藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及菌種 結核分枝桿菌人型無毒株H37Rv（利福平、異煙肼敏感菌種）由中國藥品生物制品檢定所饋贈。人白血病單核巨噬細胞THP-1由吉林大學疫苗研究實驗室饋贈。菌株和細胞均由本實驗室培養傳代保存。

1.1.2 肽類化合物及試劑 4種肽類化合物由本實驗組合成（表1）。

表14 種肽類化合物

二甲基亞砜（DMSO）；DMEM 培養基、RPMI-1640 培養基（美國Gibco 公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma 公司）；胎牛血清（FBS美國Gibco公司）；PI 染料（Sigma 公司）；其余試劑均為國產分析純，購自北京化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 多肽MIC檢測 將篩選出的4 條多肽用DMSO稀釋，使其終濃度為100、200、500、800、1 000和1 500 μg/mL，分別加到含正常培養基的H37Rv菌株培養液的24孔板中，37℃培養2-3周觀察結果。同時以利福平（RMP，濃度為0.5 μg/mL）和異煙肼（INH，濃度為0.2 μg/mL）作為陽性對照。以正常H37Rv培養液作為陰性對照。觀察長菌情況，并記錄各種多肽的MIC。

1.2.2 流式細胞術測定2號肽對THP-1細胞的毒性 收集THP-1細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液后，加入新鮮RPMI1640培養液，按4.0×105個細胞每孔接種24孔細胞培養板中，37℃，5% CO2條件下培養24 h，加入2號肽，藥物濃度分別為0、200、400、800、1 000和1 200 μg/mL，各種用藥濃度分別作用1、3、5和7 d，并分別設置加 PBS、1% DMSO、含400 μg/mL的INH為陽性對照。取出與藥物作用后的細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，再用預先冰浴的PBS緩沖溶液洗兩次，每次1.0 mL。75%冰乙醇固定過夜，離心收集細胞，用300目篩過濾一次，加碘化丙錠PI反應15 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.3 MTT法測定2號肽對細胞THP-1的毒性 將穩定感染的細胞接種于96孔板，每孔4×104個細胞。向孔內加入RPMI1640培養液（含10%胎牛血清）100 μL，其中分別含有2號肽濃度為0、500、800、1 000、1 200、1 500、1 800和2 000 μg/mL設為實驗組，同時用不含藥物的RPMI1640培養液為空白對照，含400 μg/mL的INH為陽性對照。分別于0、4及7 d向96孔細胞培養板上每孔加入10 μL濃度為 5 mg/mL的 MTT，繼續培養4 h，培養結束，取出細胞培養板，離心棄上清，每孔加100 μL DMSO，混勻后室溫放置20 min，于570 nm檢測吸光值。按下述公式計算巨噬細胞存活率。

細胞存活率（%）=（感染細菌孔A均值-培養液對照孔A均值）/（未感染細菌孔A均值-培養液對照孔A均值）×100%

1.2.4 多肽對巨噬細胞胞內H37Rv株抑制作用檢測 細菌與巨噬細胞的比例為10∶1（H37Rv濃度1×107/mL，THP-1細胞密度1×106/mL）混合，在終濃度為100 mmol/L的丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）中誘導細胞分化。96孔板每孔加100 μL菌懸液，感染4 h后，每孔加含不同濃度目的肽100 μL繼續培養，目的肽給藥濃度為0、500、800、1 000、1 200、1 500、1 800和2 000 μg/mL。同時用RPMI-1640完全培養液作空白對照，4 mg/mL的INH作陽性對照。以此時作為細菌感染零時，分別于感染后0、4及7 d去除板上培養液，每孔加入50 μL 1% Triton X-100裂解細胞。待其全部裂解后，每孔加50 μL RPMI-1640細胞培養液終止裂解?；靹蚝竺靠追謩e作1∶10和1∶100稀釋，接種于正常培養基37℃培養18 d后計CFU。

2 結果

2.1 多肽最小抑菌濃度（MIC）檢測

根據前期實驗結果，合成4條多肽，檢測其對H37Ra菌株的MIC，同時設INH和RIFD對照組，實驗結果如表2所示。1，3和4號合成多肽的MIC均為500 μg/mL，而2號多肽的MIC為200 μg/mL。而對照組中，INH組MIC為0.2 μg/mL，RIF組MIC為0.5 μg/mL。

表2 各種化合物對H37Ra的最小抑菌濃度

2.2 多肽對THP-1細胞凋亡的影響

根據以上研究結果，進一步檢測2號多肽對THP-1細胞凋亡的影響。以終濃度分別為200、400、800、1 000和1 200 μg/mL五個梯度給藥，流式細胞術檢測細胞凋亡。同時設PBS空白對照組，DMSO（1%）和INH對照組。結果（表3，圖1）表明，2號肽給藥組和INH對細胞的毒性沒有明顯差別，但這兩組細胞毒性均明顯大于PBS、DMSO（1%）對照組，且各組細胞毒性呈現一定的時相性，總體趨勢隨時間和濃度增加而增大。

2.3 MTT法測定2號肽的細胞毒性

細胞給予500-2 000 μg/mL不同劑量多肽，給藥后第4天和第7天采用MTT法檢測細胞存活率。同時設空白對照組和INH（終濃度為400 μg/mL）對照組。檢測結果（圖2）顯示，給藥后，2號多肽給藥組隨著給藥劑量的增加，細胞存活率呈劑量依賴性降低，而且第7天細胞存活率明顯低于第4天細胞存活率。其中INH組細胞存活率低于2號肽給藥組。

2.4 篩選多肽對巨噬細胞胞內H37Rv株抑制作用的測定結果

進一步檢測多肽對細胞內H37Rv菌的抑制作用。THP-1細胞經100 nmol/L PMA刺激48 h后細胞由分散、懸浮轉變為黏附、貼壁，顯微鏡下觀察細胞的形態學變化（圖3），細胞體積變大并生成偽足，表明細胞已經有效貼壁。

以結核桿菌H37Rv感染THP-1細胞，吞噬對照菌落計數表明細菌已經被細胞有效吞噬。當2號肽終濃度為2 000 μg/mL時，與INH對照相比，胞內細菌下降兩個數量級，細菌的生長被明顯抑制（圖4），這說明在較低的濃度下，2號肽表現出對胞內細菌的抑制作用。通過t檢驗分析，P＜0.05，即各實驗組對胞內菌均具有抑制作用，具有顯著性差異。

表3 不同時間、2號肽濃度下THP-1陽性細胞百分比/%

3 討論

目前多肽化學合成技術成熟，合成多肽容易與雜質或副產品分離，純度高，部分多肽比小分子藥物用量少，選擇性更強，特異性更好，作用效果好同時副作用少，更加適合臨床應用和市場開拓［7］。但是多肽也存在很多問題，例如，由于多肽分子大小，極性，親水性和帶電性等問題，使其缺乏細胞膜滲透力，影響細胞吸收［8，9］。

本課題組利用噬菌體肽庫篩選技術與計算機模擬分子對接技術優化異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑的篩選［10］。首先通過噬菌體肽庫篩選出與ICL具有高親和力的結合肽，然后利用Discovery Studio 2.1模擬分子對接，將成功對接的多肽采用Fmoc固相合成法，并對其生物活性進行檢測。結果顯示所合成多肽均對ICL的活性有明顯的抑制作用（抑制率均超過50%）［11］。本研究中進一步檢測所合成多肽的細胞毒性和胞內抑菌效果。

圖1 各種試劑對THP-1細胞毒性測定結果

圖2 不同時間、藥物濃度對細胞存活率統計

首先檢測多肽的最小抑菌濃度MIC。實驗結果證實，其中3條多肽的MIC較高（500 μg/mL），而2號多肽的MIC為200 μg/mL。本課題組設計并合成的4種肽類化合物作了多次實驗，最終能達到的最好的純化度（表1），而且純度沒有明顯差別（其中2號和3號純度幾乎一致，分別為98.8%，98.5%）。但是最小的抑菌濃度相差較多，2號肽的MIC是200 μg/mL，而3號MIC為500 μg/mL。因此，下步實驗選擇2號多肽作為研究目標。

選用人白血病單核巨噬細胞THP-1，檢測合成多肽細胞毒作用。流式細胞術檢測結果顯示，2號多肽對細胞凋亡的作用與INH對照組沒有顯著的差異。而MTT實驗結果顯示，2號多肽組細胞存活率高于INH對照組。兩組實驗結果均證實，2號多肽的細胞毒性不高于INH，且細胞毒性有劑量和時間相關效應，細胞毒性隨時間延長而增強，隨給藥劑量增大而增強。

進一步檢測合成多肽的胞內抑菌作用。THP-1細胞經100 nmol/L PMA刺激48 h后，顯微鏡下可觀察到細胞明顯的形態學變化。細胞由分散、懸浮轉變為黏附、貼壁，細胞體積變大并生成偽足，表明細胞已經有效貼壁。以結核桿菌H37Rv感染THP-1細胞，計數吞噬對照菌落。實驗結果表明，感染后細菌可在細胞內繁殖，并隨著感染時間的延長數量增加。而給予藥物后，當2號肽終濃度為800-2 000 μg/mL時，細菌的生長受到明顯的抑制，且明顯低于INH對照組（P<0.01）。這說明2號肽在較低的濃度下，就表現出對胞內細菌的抑制作用。INH對靜止期的結核分枝桿菌具有抑制作用，但是沒有殺菌作用，而且長期使用可引起耐藥性。本研究中2號多肽對結核分枝桿菌的殺菌作用好于INH，是否是因為兩種藥物對靜止期細菌的不同影響，其作用機制有待進一步探討。

圖3 PMA誘導不同時間細胞分化結果

圖4 不同時間、濃度H37Rv菌落計數統計

4 結論

多肽類抑制劑具有很好的成藥物理參數，并且能在低濃度下有效抑制細菌生長，具有成藥潛力，是理想的抗結核藥物。

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（責任編輯 李楠）

Intracellular Inhibitory Effect of Synthetic Peptide on Mycobacterium tuberculosis

CHEN Ji YIN Yu-he LI Ling-ling JIN Hao TONG Ming-yi WU Cong-mei
（School of Chemistry and Life Sciences，Changchun University of Technology，Changchun 130012）

This work is to evaluate the toxicity of the synthetic peptides on mononuclear macrophage THP-1 of human leukemia and the intracellular bacteriostatic effect on Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The minimum inhibition concentration（MIC）of the synthetic polypeptide on H37Rv was determined through the different drug concentrations of poly-peptides. Then，the toxic effects of peptide-2 on THP-1 cells were detected using flow cytometry method and MTT method. The colony-forming unit（CFU）method was used for detecting intracellular bacteriostatic effect of peptide-2 on H37Rv. Results were as below：All 4 screened peptides had bacteriostatic effect，the MIC of peptide-2 was 200 mg/mL. When the peptides-2 interacted with THP-1 cells，the cytotoxicity emerged at the concentration of 1200 mg/mL，meaning that there was no significant difference from INH’s cytotoxicity. For intracellular H37Rv，the anti-tuberculosis effects of peptide-2 presented time- and dose- dependent effect，the H37Rv colony count was obviously decreased with the increase of the time and dose. In conclusion，not only has the peptide-2 small toxicity to the macrophage THP-1，but also solid intracellular anti-M. tuberculosis effect，and it can be a new and potential anti-tuberculosis drug.

synthetic peptide；Mycobacterium tuberculosis；macrophage；intracellular inhibitory

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.030

2015-07-06

吉林省科技發展計劃項目（2008110）

陳吉，男，碩士，研究方向：生物工程學；E-mail：415786094@qq.com

吳叢梅，女，教授，研究方向：生物工程學；E-mail：wucmyue@sina.com