PTEN mRNA編輯的間充質干細胞對神經膠質瘤U251細胞殺傷作用研究

郭興榮 王小莉 袁雅紅 涂漢軍

（十堰市太和醫院 胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室 湖北醫藥學院，十堰 442000）

PTEN mRNA編輯的間充質干細胞對神經膠質瘤U251細胞殺傷作用研究

郭興榮 王小莉 袁雅紅 涂漢軍

（十堰市太和醫院 胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室 湖北醫藥學院，十堰 442000）

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有向腫瘤組織遷移趨化的特性，所以它被認為是一種攜帶特殊基因進行腫瘤的靶向治療的理想載體。與不同形式的DNA載體相比，體外合成的mRNA更容易轉染并且不會引入突變。利用間接共培養方法研究PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）mRNA編輯的MSCs對U251-Luc細胞殺傷作用。體外轉錄合成PTEN mRNA，轉染到MSCs，利用Western blot方法檢測轉染后PTEN蛋白表達情況，transwell共培養方法分析轉染PTEN mRNA對MSCs腫瘤細胞遷移趨化性影響。利用活體成像儀和熒光顯微鏡檢測在間接共培養條件下PTEN mRNA編輯的MSCs對U251-Luc細胞殺傷作用。體外成功合成PTEN mRNA，轉染到U251-Luc細胞后能正確表達PTEN蛋白，并且在轉染24 h表達最高。與對照組相比，轉染PTEN mRNA后能一定程度提高MSCs細胞對腫瘤遷移能力（P<0.05）。PTEN mRNA編輯的MSCs培養上清能顯著抑制U251-Luc細胞生長（P<0.05）。體外合成抑癌基因mRNA的方法為MSC介導的靶向基因治療神經膠質瘤提供新思路。

間充質干細胞；合成mRNA；PTEN；基因治療；U251神經膠質瘤細胞

神經膠質細胞瘤（Gliomas），簡稱膠質瘤，是顱內最常見的惡性腫瘤，以高發病率、高復發率、低治愈率和高病死率等特點著稱［1］。Westphal等［2，3］認為由于膠質瘤細胞組成復雜、彌散性分布以及具有高耐藥性等，近30年來對腦膠質瘤的治療沒有較大突破。目前限制膠質瘤或其它腫瘤的治療效率的關鍵因素之一是常規方法缺乏腫瘤的特異性，所以，急需開發安全高效的靶向治療腦膠質 瘤新方法。

MSC介導的基因治療被認為是 非常有潛力的治療方法［4-7］。MSCs 的腫瘤組織趨向性已經通過體外transwell實驗和在動物體內腫瘤模型實驗證實。利用MSC的腫瘤歸巢性，讓它攜帶特定抑癌基因可在腫瘤組織附近一直表達抗癌蛋白，從而達到靶向殺死腫瘤細胞目的。MSC介導的基因治療方法很多，其中以DNA載體或病毒載體最為常見，但這些方法有都會存在引入基因重組或突變的問題。因此，不會引入基因突變又能安全應用于臨床腫瘤治療的MSC介導的基因治療方法將是腫瘤治療的理想藥物。體外合成穩定的mRNA 方法將有可能替代常用的DNA載體方法（pDNA）［8］，體外合成mRNA 的方法已廣泛應用于多能干細胞或體細胞編程和誘導分化中［9-12］。

PTEN基因是1997年首次發現、位于人體10號染色體（10q23.3）的一種抗癌基因［13-15］。幾乎所有腦膠質瘤患者都伴有PTEN活性低下，高達40%腦膠質瘤是由PTEN基因突變所致［16］。PTEN活性低下是眾多腫瘤細胞的普遍現象，以增強PTEN活性為手段的抗癌研究一直受到廣泛的關注。

本研究擬采用體外合成的PTEN mRNA來編輯MSC，然后利用間接共培養方法研究PTEN mRNA對腦膠質瘤U251細胞的殺傷抑制作用，以此探討體外合成的PTEN mRNA是否能成為有效治療腦膠質瘤病人候選藥物之一。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

胰腺MSCs的分離和培養如本實驗室之前方法所述［17］。人腦膠質瘤U251美國菌種典藏中心（ATCC，Manassas，VA，USA）。U251和MSCs細胞培養條件參照ATCC培養條件［18］。為了實時動態觀察U251細胞生長情況，熒光素酶pGL4.51［luc2/CMV/ Neo］（Promega，USA）載體穩定轉染到該細胞。

1.2 體外合成PTENmRNA和MSCs的轉染

體外構 建轉錄模板和RNA合成示意圖如圖1所示。寡核苷酸序列體外合成的反轉錄模板如表1所示。人5' UTR 的 Kozak序列和3' UTR 序列由 DNA合成技術公司（Coralville，Iowa）合成，克隆到pcDNA3.3載體上，命名為pcDNA 3.3-TOPO TA 載體。如之前文章所述［9］，用限制內切酶切割質粒，并作為tail PCRs 的模板。利用MEGAscript T7試劑盒（Ambion）合成，將ARCA 帽子類似物（New England Biolabs），三磷酸腺苷，GTP，5-甲基胞嘧啶和假尿嘧啶（TriLink Biotechnologies）等核糖核苷酸混合物37℃孵育5 h后，用堿性磷酸酶37℃（New England Biolabs）處理2 h去除5'-三磷酸。合成的RNA用 Ambion MEGAclear spin columns（Ambion）純化并用Nanodrop（Thermo Scientific）測定濃度。TransIT-mRNA（Mirus）轉染試劑進行RNA的轉染，Opti-MEM 基礎培養基（Gibico）稀釋RNA，然后依次加入Boost 溶液和TransIT-mRNA，混勻室溫放置2 min，把RNA和脂質體復合物加入到待轉染的細胞培養基中。分別在轉染12，24 和 36 h利用Western blot檢測PTEN蛋白表達情況。

1.3 間接共培養法檢測腫瘤細胞活力

利用間接共培養的方法分析PTEN編輯的MSCs對膠質瘤細胞增殖毒性作用。在第0天，將熒光素酶標記的U251（U251-Luc）細胞按5 000 個/孔密度加入100 μL MEM 培養基接種于96孔，在第1天將培養基換為從MSCs（CM）或轉染PTEN RNA的MSC（CMPTEN）條件培養基，按0%，25%，50%，75%，100%（MSCPTEN/ CM from MSC control）5個濃度梯度加入100 μL 培養基。在第0，3和6天，每孔加入 1 μL（0.15 mg/mL）D-熒光素（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA），培養10 min后，利用小鼠活體成像儀（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）檢測熒光素酶發光強度。每間隔36 h更換一次培養基，每組至少重復檢測3次以上。

表1 體外合成 PTEN mRNA引物

1.4 Transwell 共培養系統檢測MSCs的遷移能力

細胞遷移能力檢測參考Nakamizo 等［19］方法。將U251-Luc細胞按1×105個/孔密度接種到24孔板，第2天待細胞貼壁后，野生型MSCs 和 MSCPTEN按×104個/孔密度接種到transwell（Corning，Inc.，Corning，NY）的微孔膜（8 μm）上，用無血清培養基37℃ 和 5% CO2培養48 h，用PBS 清洗微孔膜，然后用棉簽將膜上層細胞刮下。利用95%乙醇固定transwell的微孔膜，然后用0.1%結晶紫染色30-60 min。在顯微鏡視（100×）野下，每組隨機選取5個不同視野計數細胞遷移數目。每組實驗至少重復3次以上。為了檢測正常細胞對MSCs細胞 遷移能力影響，用野生型的MSCs 細胞替代U251-Luc細胞。

1.5 Western blotting分析

用細胞刮刮下6孔板中MSCs 細胞，PBS洗2-3次后，加入100-200 μL細胞裂解buffer（Beyotime）冰上裂解 30 min，用BCA試劑盒（Beyotime）測定蛋白濃度。 按每個點樣孔（50 μg/每孔），用12% SDS-PAGE膠分離后轉膜。室溫封閉1 h后，4℃一抗（PTEN，（R&D Systems，Minneapolis，USA））撫育過夜。TBST洗3遍，每次5 min，ECL標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，顯色，照相。檢測分泌到培養基中的PTEN表達情況時，收集條件培養基，用0.22濾膜過濾后用冷凍干燥儀（cat # 42406；Millipore，Millerica，MA，USA）濃縮。

1.6 熒光顯微鏡分析

利用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit（Invitrogen）檢測細胞活力，按說明書并適當修改操作。 具體步驟如下：按1×105細胞密度將U251 接種到24孔板并加入500 μL的 MEM 培養基作為第0天。 在第1天培養基換為50 或者100% 條件培養基（正常培養基加入一定比例轉染PTEN mRNA MSC培養24 h 上清）。在培養第4天，細胞用PBS洗2遍后，加入新鮮配制的工作液（250 μL/孔，24板，含1 μmol/L calcein AM 和2 μmol/L EthD-1）避光室溫孵育10 min。熒光顯微鏡（IX71；Olympus）下觀察照相，并利用軟件（provided online by the National Institute of Health of USA）分析相關比例。

1.7 統計學分析

應用SPSS.10統計學軟件，組間差異采用兩樣本均數t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05表示差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 體外合成PTEN mRNA和在MSCs細胞中表達分析

PTEN mRNA合成流程如圖1-A所示，為了使翻譯的PTEN蛋白產物具有跨膜分泌特性（stPTEN），在編碼PTEN蛋白的DNA序列前加分泌肽DNA序列（MKFPSQLLLLLLFGIPGM）和跨膜肽DNA序列（TAT，YGRKKRRQRRR）（圖1-B）。 以之前構建的pDsRed1-TAT-PTEN載體［18］為模板克隆stPTEN DNA序列（圖2A-a），然后把克隆得到的PCR產物雙酶切后連接到pcDNA 3.3-TOPO TA載體。將菌落PCR和酶切篩選得到的陽性克?。▓D2A-b，c），送上海生工測序，經比對完全正確的序列用限制性酶切后的產物作為tail PCR 的模板（圖2A-d）。如圖2-B 所示，向MSCs轉染PTEN mRNA 后PTEN蛋白的表達顯著增強。對照組中內源性的PTEN 蛋白與轉染組PTEN 蛋白略微小些，轉染24 h后PTEN 蛋白表達最高，36 h后逐漸降低。在培養上清也檢測到PTEN蛋白表達，說明合成的PTEN mRNA表達的蛋白具有分泌特性。

2.2 轉染PTEN mRNA后對 MSC遷移能力的影響

利用transwell系統分析 MSC遷移能力。將U251-LUC和MSCs 或 MSCPTEN細胞間接共培養 48后，大量的MSCs 或 MSCPTEN對U251-LUC細胞有趨向作用遷移穿過濾膜（圖3-A），然而幾乎很少細胞對正常MSC細胞有趨向作用遷移穿過濾膜（圖3-B）。而且，與對照MSC細胞相比轉染PTEN-mRNAs 的MSC細胞對 U251 細胞的趨向能力更強（圖3-C）。

圖1 體外合成 PTEN mRNA（A）和 分泌性 PTEN（stPTEN）融合蛋白（B）流程圖

2.3 PTEN編輯的MSCs對U251-LUC細胞的活力影響

利用活體成像儀器檢測U251細胞中LUC發光強弱分析PTEN編輯的MSCs間接共培養對U251-LUC細胞活力影響。如圖 4-A所示，隨著條件培養基（CM）比例的提高U251細胞的發光強度逐漸降低。每個濃度梯度統計分析結果如圖 4-B所示，在CM（25%）作用下，共培養6天U251細胞死亡率達47.7%，（P<0.05）。然而在共培養的第 3天，在CM（100%）作用下已經開始有細胞死亡（P<0.05），而其他濃度的CM作用下基本不會引起細胞死亡。

為了進一步檢測PTEN編輯的MSCs對U251-LUC細胞致死作用，用50%和100%CM培養 U251-LUC細胞4 d后用LIVE/DAED Viability/Cytotoxicity Assay Kit分析，在熒光顯微鏡觀察被染為紅色（死細胞）和綠色（活細胞）細胞數量。如圖5所示，U251-LUC細胞死亡數量與CMPTEN培養基比例 成正比，劑量依賴的致死率表明轉染PTEN mRNA 的MSCs分泌到培養上清PTEN蛋白可通過間接培養直接導致 U251-LUC細胞死亡。而在正常MSC細胞的條件培養基作用下沒有發現明顯的細胞死亡。

圖2 體外合成PTEN mRNA和轉染到MSCs表達檢測

圖3 體外檢測MSCs的遷移能力

3 討論

惡性膠質瘤是一種很難治愈的腫瘤，主要是由于它的生長位置和生物學特性決定，例如（i）滲透特性，（ii）凋亡耐受性，（iii）高復發性，（iv）高耐藥性［3］。自從MSCs 的腫瘤趨向性被發現以來，利用特定抗癌基因編輯的MSCs已逐漸成為最有潛力的靶向治療膠質瘤方法［20-22］。然而，用病毒或質粒載體攜帶抗癌基因的MSCs不能應用于臨床治療。

最新的體外合成mRNA方法是一種安全高效的基因治療方法［11］，它可完全排除對宿主基因的修飾［23，24］，并已被證實可應用于臨床研究［25］。 因此，利用體外合成特定抗癌基因mRNA編輯MSCs的方法具有臨床應用價值。

PTEN基因表達的缺失或低表達廣泛存在于腫瘤細胞包括膠質瘤細胞，說明該基因的表達是影響腫瘤細胞的存活關鍵因素［26］。PTEN功能的恢復將有可能抑制腫瘤生長和在特定情況下誘導其死亡。同時有研究發現細胞中表達的PTEN蛋白可分泌到胞外再進入其他細胞影響細胞信號轉導和存活［27］。鑒于此，我們體外合成能表達分泌PTEN蛋白的mRNA，并用它編輯MSC應用于治療癌癥研究，探討它潛在的臨床應用價值。如圖2-B所示，轉染合成的PTEN mRNA 24 h后在MSCs 表達達到高峰。并且表達出PTEN蛋白的分泌特性與我們之前在這個細胞模型用DNA載體轉染表達效果一致［19］。

我們前期研究發現利用DNA載體攜帶的抗癌基因編輯的MSCs 可抑制胰腺癌細胞和腦膠質瘤細胞生長［19，28］。為了保證臨床應用的可行性，必須確定轉染mRNA后是否會影響MSCs對腫瘤細胞的遷移性。如圖3所示，轉染 PTEN-mRNA 并不會抑制MSCs的遷移性，而MSCs對U251細胞的遷移性反而還有一定程度增強，我們推測高表達的PTEN蛋白可能可以影響MSCs細胞中控制腫瘤遷移特性蛋白表達或活性，關于這個潛在的機制還需要進一步深入研究。通過間接共培養方法，我們發現轉染PTEN-mRNA的培養上清能顯著抑制U251-LUC細胞生長并促進其凋亡，并且這種作用還有劑量依賴（圖4，圖5）。然而體外合成的PTEN-mRNA表達的蛋白分泌到培養基后，是否是通過進入U251-LUC細胞或是其他方式來抑制其生長和促進其凋亡作用，在后續研究中將深入討論。

圖4 利用活體成像檢測儀分析U251-Luc細胞活力

4 結論

本研究首次利用體外合成的PTEN mRNA修飾MSC作用于膠質瘤細胞，開發了一種安全可靠和高效基因治療腫瘤新方法。利用MSC介導的基因靶向治療腫瘤具有兩種優勢，一方面是由于MSCs本身具有腫瘤趨向性，另一方面是可攜帶特定抗癌藥物。同時這種方法還具有潛在優勢。

圖5 間接共培養分析U251-Luc cell 細胞活力

［1］Van Meir EG, Hadjipanayis CG, Norden AD, et al. Exciting new advances in neuro-Oncology the avenue to a cure for malignant glioma［J］. CA Cancer J Clin, 2010, 60（3）：166-193.

［2］Westphal M, Lamszus K. The neurobiology of gliomas：from cell biology to the development of therapeutic approaches［J］. Nat Rev Neurosci, 2011, 12（9）：495-508.

［3］Ferguson SD. Malignant gliomas：diagnosis and treatment［J］. Neuro Surgery, 2011, 57（11）：558-569.

［4］Loebinger MR, Janes SM. Stem cells as vectors for antitumour therapy［J］. Thorax, 2010, 65（4）：362-369.

［5］Dai LJ. Potential implications of mesenchymal stem cells in cancer therapy［J］. Cancer Lett, 2011, 305（5）：8-20.

［6］Buono R, Abrate A, Esposito A, et al. Mesenchymal stem cell mediated cancer therapy inhibits tumor growth in the transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate（Tramp）model［J］. J Urology, 2013, 189（5）：203-207.

［7］Zhang X, Zhang L, Xu W, et al. Experimental therapy for lung cancer：umbilical cord-Derived mesenchymal stem cell-mediated interleukin-24 delivery［J］. Curr Cancer Drug Tar, 2013, 13（1）：92-102.

［8］Leonhardt C, Schwake G, St?gbauer TR, et al. Single-cell mRNA transfection studies：Delivery, kinetics and statistics by numbers［J］. Nanomed-Nanotechnol, 2014, 10（4）：679-688.

［9］Wang XL, Hu p, Guo XR, et al. Reprogramming human umbilical cord mesenchymal stromal cells to islet-like cells with the use of in vitro-synthesized pancreatic-duodenal homebox 1 messenger RNA［J］. Cytotherapy, 2014, 16（11）：1519-1527.

［10］Guo XR, Wang XL, Li MC, et al. PDX-1 mRNA-induced reprogramming of mouse pancreas-derived mesenchymal stem cells into insulin-producing cells in vitro［J］. Clin Exp Med, 2014, 10（1）：152-160.

［11］ Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, et a l. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA［J］. Cell Stem Cell, 2010, 7（5）：618-63 0.

［12］ Zangi L, Lui KO, von Gise A, et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction［J］. Nat Biotechnol, 2013, 31（10）：898-907.

［13］Liu W, Zhou Y, et al. PTEN mutation：many birds with one stone in tumorigenesis［J］. Anticancer Res, 2008, 28（6A）：3613 -3619.

［14］Ciuffreda L, Falcone I, Incani UC, et al. PTEN expression and function in adult cancer stem cells and prospects for therapeutic targeting［J］. Adv Biol Relat, 2014, 5 6：66-80.

［15］Muniyan S, Ingersoll MA, Batra SK, et al. Cellular prostatic acid phosphatase, a PTEN-functional homologue in prostate epithelia, functions as a prostate-specific tumor suppressor［J］. BBA, 2014, 1846（1）：88-98.

［16］ Chalhoub N, Baker SJ. PTEN and the PI3-kinase pathway in cancer［J］. Annu Rev Pathol, 2009, 4（1 1）：127-150.

［17］Moniri MR, Sun XY, Rayat J, et al. TRAIL-engineered pancreasderived mesenchymal stem cells：characterization and cytotoxic effects on pancreatic cancer cells［J］. Cancer Gene Ther, 2012, 1 9（9）：652-658.

［18］Yang ZS, Tang XJ, Guo XR, et al. Cancer cell-oriented migration of mesenchymal stem cells engineered with an anticancer gene（PTEN）：an imaging demonstration［J］. Oncotargets Ther, 2014, 7：441-446.

［19］ Nakamizo A, Marini F, Amano T, et al. Human bone marrowderived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas［J］. Cancer Res, 2005, 65（12）：3307-3318.

［20］ Menon LG, Kelly K, Yang HW, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells expressing S-TRAIL as a cellular delivery vehicle for human glioma therapy［J］. Stem Cells, 2009, 27（28）：2320-2330.

［21］ Dwyer RM, Khan S, Barry FP, et al. Advances in mesenchymal stem cell-mediated gene therapy for cancer［J］. Stem Cell Res Ther, 20 10, 22（6）：2012-2018.

［22］ Knoop K, Kolokythas M, Klutz K, et al. Image-guided, tumor stroma-targeted I-131 therapy of hepatocellular cancer after systemic mesenchymal stem cell-mediated NIS gene delivery［J］. Mol The r, 2011, 19：1704-1713.

［23］ Li M, Sancho-Martinez I, Belmonte J C, et al. Cell fate conversion by mRNA［J］. Stem Cell Res Ther, 2011, 15（11）：2-5.

［24］ Kormann MS, Hasenpusch G, Aneja MK, et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice［J］. Nat Biote chnol, 2011, 29（2）：154-157.

［25］ Neyns B, Heirman C, Thielemans K, et al. Immunotherapy of cancer with dendritic cells loaded with tumor antigens and activated through mRNA electroporation［J］. Methods Mol B iol, 2010, 629（3）：405-452.

［26］Leslie NR, Downes CP. PTEN function：how normal cells control it and tumour cells lose it［J］. Bioch em J, 2004, 382（Pt 1）：1-11.

［27］Benjamin DH, Fine B, Steinbach N, et al. A secreted PTEN phosphatase that enters cells to alter signaling and survival［J］. Science, 2013, 341（6411）：399-402.

［28］ Roshan MM, Young A, Reinheimer K, et al. Dynamic assessment of cell viability, proliferation and migration using real time cell analyzer system（RTCA）［J］. Cytotechnology, 2014, 67（2）：379-386.

（責任編輯 李楠）

The Cytotoxic Effects of PTEN-mRNA-engineered Mesenchymal Stem Cell on U251 Glioma Cells

GUO Xing-rong WANG Xiao-li YUAN Ya-hong TU Han-jun
（Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000）

Mesenchymal stem cells（MSCs）have been considered of great potential as ideal carriers for the delivery of anticancer agents since the discovery of their capacity of tumor-oriented migration and integration. Differing from DNA-bas ed vectors，synthesized mRNA in vitro owns the properties of its easy t ransfection and mutagenesis-free. This study aims to investigate the effects of phosphatase and tensin homolog（PTEN）mRNA-engineered MSCs on human glioma U251 cells under indirect co-culture cond ition. PTEN mRNA by in v itro transcription was transfected into MSCs，and then the expression of protein PTEN in the transfected MSCs was detected by Western blot，and the migration and integration effects of PTEN mRNA transfection on MSC tumor cells were verified using transwell co-cultures. The cytotoxic effects of PTEN mRNA-engineered MSCs on the U251-Luc glioma cells were detected with luminescence and fluo rescence microscopy under indirect co-culture condition. The in vitro synthesized PTEN mR NA was transfected to U251-Luc cells，protein PTEN expressed correctly and the expression was the highest at 24 hours after transfection. An enhanced migration rate was observed with MSCs transfected with PTEN mRNA compared to nontransfected MSCs（P<0.05）. A significant inhibition of U251 cells was observed when they were cultured with conditioned medium from PTEN mRNA-engineered MSCs（P<0.05）. The results suggest that anticancer gene-bearing mRNA synthesized in vitro provides new insights into the MSC-mediated targeted gene therapy of glioblastoma.

mesenchymal stem cells；synthesized mRNA；PTEN；gene therapy；U251 glioma cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.032

2015-08-13

湖北省自然科學基金項目（2014CFA068），湖北省衛生計生委一般項目（WJ2015MB223），國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201410929005）

郭興榮，女，博士，研究方向：腦腫瘤預防與治療；E-mail：gxrdl@126.com

涂漢軍，男，博士，教授，研究方向：腦膠質瘤預防與治療；E-mail：sythj@sina.com