Thermusaquaticus DNA連接酶的連接特性研究?

于　欣， 王　靜， 安　然， 梁興國

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

ThermusaquaticusDNA連接酶的連接特性研究?

于欣， 王靜， 安然， 梁興國??

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

摘要：為進一步研究Thermus aquaticus (Taq) DNA連接酶的作用機理、開發以DNA連接作為關鍵步驟的新生物技術，本文以含有超穩定發卡結構的DNA(帶有11nt長的單鏈部分)和另一條單鏈DNA為連接底物，研究了片段長度、反應溫度、連接位點的結構特性、聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)的添加等對連接的影響，探討了Taq DNA連接酶的連接特性。連接結果顯示:單鏈DNA的3’端同發卡結構I底物相連的連接率，比單鏈DNA的5’端同發卡結構II底物相連的連接率更高；可以連接的最短單鏈DNA片段的長度為6nt；在20～65℃范圍內，一般連接率隨溫度升高而升高。在連接時，由2條底物通過互補配對形成的復合體的熱穩定性對連接率影響不大，一般在連接溫度遠遠高于該復合體的熔點(Melting Temperature, Tm)時仍有很高的連接率。在70或75℃時，雖然連接率有所降低，但仍然可以連接9nt的單鏈DNA片段。研究還發現，在片段連接上，PEG 6000對較難連接的片段(6～7nt)有促進作用，對容易連接的片段(8～10nt)促進作用不顯著，甚至有一定抑制作用。

關鍵詞：Taq DNA連接酶；發卡結構；短片段

引用格式：于欣，王靜，安然，等. Thermus aquaticus DNA連接酶的連接特性研究[J].中國海洋大學學報(自然科學版)， 2016, 46(5)： 50-55.

YU Xin, WANG Jing, AN Ran, et al. Investigation of the ligation characteristics of thermus aquaticus DNA ligase[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(5): 50-55.

DNA連接酶在DNA的復制、重組和修復過程中扮演重要角色[1]。它以ATP或NAD+作為輔酶來催化2個DNA鏈之間的3’-羥基(3’-OH)和5’-磷酸(5’-P)形成磷酸二酯鍵。這2類連接酶的反應機理相近：(1)NAD+或ATP將其腺苷?；D移到DNA連接酶賴氨酸殘基的ε-氨基上，形成酶-腺苷酸共價復合物中間體，同時釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)然后，酶-腺苷酸共價復合物上的腺苷?；D移到DNA鏈的5’-P，形成被激活的焦磷酸鍵；(3)最后，相鄰鏈的3’-OH與被激活的5’-P結合在2條鏈之間形成磷酸二酯鍵，同時釋放出一磷酸腺苷(AMP)[2-7]。常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶、T4 DNA連接酶和Thermusaquaticus(Taq) DNA連接酶等。T4 DNA連接酶來源于T4噬菌體，是ATP依賴的DNA連接酶，可連接雙鏈DNA的黏性末端和平末端。但它只能在低于37℃的溫度下使用，且對于堿基錯配(Mismatch)不敏感[8]。TaqDNA連接酶熱穩定性高，來源于ThermusaquaticusHB8，是NAD+依賴的連接酶，在45～65℃均有很強的活性[9-10]。

隨著生物技術的深入發展，連接酶的應用越來越廣泛。例如，T4 DNA連接酶在基因工程中常被用于將目的片段與載體連接，構建新的表達載體；它也可用于連接酶介導的PCR等基因檢測技術[11]。但是由于T4 DNA連接酶錯配區分能力較差，連接特異性低，容易出現假陽性。而熱穩定的TaqDNA連接酶，區別錯配的能力明顯高于T4 DNA連接酶，因此TaqDNA連接酶可更好地應用于檢測技術。T4 DNA連接酶發現較早，其連接特性已得到了較深入研究[7,12-13]，但一般認為TaqDNA連接酶只能連接較長的黏性末端或切口部位，對其連接特性，尤其是短鏈的連接還很少有報道，因此本研究對其連接特性進行了系統研究，可為開發與DNA連接酶相關的生物技術提供依據。

由于TaqDNA連接酶的連接溫度較高(65℃)，一般需要足夠長的DNA雙鏈(>22nt)來確保該雙鏈在連接溫度下不發生解鏈[9-10]，很難研究更高溫度(如70℃)的連接特性。另外，使用雙鏈底物時很難保證連接的寡核苷酸片段以1∶1的比例加入。我們注意到有些短的發卡結構在高溫下很穩定，如環區序列為GNA或GNNA的發卡結構都非常穩定。而且發卡結構在分子內形成，一條鏈即可形成連接所需的黏性末端結構，而且莖部只有5～6個堿基(GC含量較高)時，其Tm值就可達到80℃[14-15]。因此，為簡化設計和降低實驗成本，本研究選用環區序列為GAA的穩定發卡結構作為連接底物來探究TaqDNA連接酶的連接特性。

1材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

T4多聚磷酸激酶和0’RangeRulerTM5 bp DNA ladder購自Thermo Scientific公司；TaqDNA連接酶購自New England Biolabs公司；Eva Green購自Biotium公司；短鏈DNA(見表1)由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成；其他試劑均為國產分析純試劑；PCR儀購自杭州博日科技有限公司；電泳設備購自北京六一儀器廠；凝膠成像儀購自美國BIO-RAD公司。

表1　連接所用穩定發卡結構和短片段

注：所標注的發卡結構I(Hp-I)分別與I-5～I-10片段進行連接反應，所標注的發卡結構II(Hp-II)分別與II-5～II-10片段進行連接反應。Hp-I ligated to oligonucleotides from I-5 to I-10 and Hp-II ligated to oligonucleotides from II-5 to II-10.

1.2 寡核苷酸片段5’-羥基的磷酸化

在100μL的反應體系中含有：1.5mmol/L ATP，1×T4 DNA多聚磷酸激酶緩沖液(50mmol/L Tris-HCl(pH=7.6，25℃)，10mmol/L MgCl2，5mmol/L DTT，0.1mmol/L亞精胺)，20U的T4多聚磷酸激酶，10μmol/L寡核苷酸片段；將含有以上反應體系的EP管置于PCR儀上，37℃反應4h，75℃ 10min(滅活多聚磷酸激酶)[16]；反應后不經處理直接用于后續連接反應。

1.3 連接反應

在10μL的反應體系中含有：1μmol/L發卡底物，1μmol/L短片段，1×TaqDNA連接酶緩沖液(20mmol/L Tris-HCl(pH=7.6)，25mmol/L KAc，10mmol/L Mg(Ac)2，10mmol/L DTT，1mmol/L NAD和0.1% Triton X-100)，12UTaqDNA連接酶；將含有以上反應體系的EP管置于PCR儀上，20～65℃反應一定時間，進行電泳分析。

1.4 電泳分析

取1.5μL連接反應溶液，用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。電泳后用溴化乙錠染色15min后置于凝膠成像儀(Gel Doc XR+)上成像。

1.5 Image Lab軟件分析電泳連接率

用Image Lab軟件定量分析條帶的亮度，具體的連接率由以下公式計算。

Y=aε/(aε+b)。

式中：Y為連接率;a為連接產物的條帶的亮度；b為未連接發卡結構I或II條帶的亮度；ε為修正系數。

片段連接后因堿基數的增多亮度會增加，計算連接反應率時應予以修正，因此引入修正系數ε。假定堿基對的數目同DNA染色后的熒光強度成線性關系，經計算6～10nt片段的修正系數分別是：0.71、0.69、0.67、0.65和0.63。

2結果

2.1 底物設計

本研究的連接溫度主要采用20～65℃，需要發卡底物的熔點至少65℃，因此擬采用環區序列為GAA的穩定性強的發卡結構作為連接底物(序列見表1)。發卡結構I(見圖1-I中發卡)和發卡結構II(圖1-II中發卡)的莖干區堿基數分別是7和8bp，單鏈部分都是11nt，用于同連接的單鏈DNA結合(見圖1)。測得其Tm值(Melting temperature)在65℃左右，滿足研究對于連接底物穩定性的要求。發卡結構I和II分別有3’突出的黏性末端和5’突出的黏性末端，可以研究連接反應的方向性對連接率的影響，連接原理見圖1。

2.2 不同長度片段連接情況

本研究采用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析連接產物，圖2A和2B分別是結構I序列組和結構II序列組分別在20、37、45和65℃下連接12h的電泳結果。

(I：3’突出黏性末端的發卡結構與5～10nt短片段的3’連接；II：5’突出黏性末端的發卡結構與5～10nt短片段的磷酸化的5’連接.●:TaqDNA連接酶。I: Hairpin with 3’-sticky end ligated to the 3’-end of 5～10 nt fragments; II: Hairpin with 5’-sticky end ligated to the phosphorylated 5’-end of 5～10 nt fragments. ●:TaqDNA ligase.)

圖1TaqDNA連接酶對不同長度單鏈DNA片段連接原理圖

Fig.1Scheme ofTaqDNA ligase ligating

single-stranded DNA of various lengths

由于連接產物比未連接產物長5～10個堿基，因此連接后遷移率顯著降低，足以同原料完全分開，便于進行定量分析。未連接的短片段由于過短而未能染色，電泳圖上未顯示(見圖2)。從圖2A可以看出結構I序列組，5nt片段在不同溫度下沒有連接產物，即使延長連接反應時間到96h也未發現發生連接(數據未顯示)；6～10nt片段的連接率隨片段長度增長而增加；6～10nt在45℃時連接率最高，在20～45℃的范圍內連接率隨溫度升高而升高。圖2B顯示，對于結構II，5nt片段也不連接，能連接的6～10nt片段的連接率也隨片段長度增長而升高；6～10nt片段在20～65℃范圍內的連接率隨溫度升高而升高。

(L: Ladder；N：負對照。A:5～10nt片段(見圖1，Hp-I)與發卡底物Hp-I在20、37、45和65℃溫度下連接12h產物電泳圖。B：5～10nt片段(見圖1，Hp-II)與發卡底物Hp-II在20、37、45和65℃溫度下連接12h產物電泳圖。L:Ladder; N: Negative control. A： Hp-I ligated to fragments from I-5 to I-10 for 12 h. B： Hp-II ligated to fragments from II-5 to II-10 for 12 h.)

圖2不同溫度下各片段連接產物電泳圖

Fig.2Effects of reaction temperature on the

ligation efficiency of various fragments

綜上所述：(1)圖2A和2B比較分析，結構I相同長度片段同一溫度下連接率明顯高于結構II連接率；(2)結構I和結構II序列組中，只有5nt片段無法連接；(3)TaqDNA連接酶所能連接的最短片段是6nt長的片段，但是除45℃外，其他溫度連接率都很低；(4)不同片段長度連接率不同，大致連接率順序是10nt>9nt>8nt>7nt>6nt；(5)溫度越高連接率越高，但是6nt片段在65℃時連接率遠低于45℃。

2.3 不同長度片段的連接速率比較和反應溫度對反應速率的影響

要詳細研究反應溫度和反應時間對連接效率的影響，需要對連接情況進行定量分析。本文采用Image Lab軟件對電泳得到的各個條帶進行定量分析，計算出產物的連接率，分析結果如圖3所示。圖3A和3C分別是結構I和結構II在45℃下同6～10nt片段產物的連接率隨時間變化的折線圖。明顯看出，片段越長連接速度越快。如結構I，10nt片段在3h就已完全連接，而6nt片段在48h時連接率只有91.8%(見圖3A)。對于結構II，不同長度的片段之間的連接速度差別更大(見圖3C)。為了進一步比較溫度對各長度片段連接效率的影響，考察了在各溫度下反應6h的定量分析結果(見圖3B(結構I)和圖3D(結構II))?？傮w看來，連接率隨溫度升高而增加。例如，對于7nt連接片段和Hp-I(結構I)的連接，以及8～10nt片段和Hp-II(結構II)的連接，都是溫度越高連接率越高。而8～10nt片段和Hp-I(結構I)的連接，45和65℃在現有條件下看不出差別。在55℃下連接時，連接率介于45和65℃之間(數據未顯示)，對以上結論影響不大。我們還試驗了70和75℃下9nt片段同Hp-I(結構I)的連接，發現連接率明顯下降，但有意思的是即使在75℃高溫時仍有較多產物產生，說明TaqDNA連接酶在75℃仍有活性(見圖4)。意外的是，采用另外設計的連接體系發現，15nt長的片段在75℃下的連接率甚至高于65℃的連接率(數據未顯示)。

2.4 PEG 6000對連接率的影響

據報道PEG 6000對有些連接反應有促進作用，本研究在連接體系中加入PEG，探索PEG對短片段連接的影響。實驗結果顯示，結構I和結構II在不同溫度，不同連接時間，與短片段(6和7nt)連接，加入PEG后連接率有一定升高，而較長片段(8～10nt)加入PEG后促進作用下降甚至發生抑制作用(數據未顯示)?，F以差異較明顯的結構I在45℃、反應3h條件下的連接產物為例，介紹PEG對連接反應的影響。根據圖5可以發現，結構I在PEG加入后，6nt片段的連接率從10.6%增加到20.6%，7nt片段從33.1%增加到61.6%，8～10nt片段連接率在加入PEG后反而有所下降。

(A：45℃條件下6～10nt片段與發卡底物Hp-I(見圖1，結構I)在不同時間的連接率。B：6～10nt片段與發卡底物Hp-I(見圖1，結構I)在不同溫度下連接6h連接率。C：45℃條件下6～10nt片段與發卡底物Hp-II(見圖1，結構II)片段在不同時間的連接率。D：6～10nt片段與發卡底物Hp-II(見圖1，結構II)在不同溫度下連接6h連接率。A： Ligation ratio of hairpin-I ligating to the fragments from I-6 nt to I-10 nt at 45℃. B： Ligation ratio of hairpin-I ligating to I-6 nt～I-10 nt at various temperatures for 6 h. C： Ligation ratio of hairpin-II ligating to the fragments from II-6 nt to II-10 nt at 45℃. D： Ligation ratio of hairpin-I ligating to I-6 nt～I-10 nt at various temperatures for 6 h.)

圖3反應時間以及溫度對不同長度片段連接率的影響

Fig.3Effects of reaction time and temperature on ligation ratio of various length fragments

(L：Ladder；N：不加連接酶空白對照Negative control.)

圖5　PEG對6-10nt片段(I)的連接率的影響(45℃連接3h)

3討論

本文利用穩定的發卡結構探索了TaqDNA連接酶在不同條件下的連接情況。通過比較2種結構在不同溫度下與不同長度片段的連接率，發現3’突出黏性末端的發卡結構(Hp-I)更易與短片段連接。研究結果顯示，對于足夠長的黏性末端TaqDNA連接酶所能連接的最短DNA片段是6nt。另外，總結不同溫度下各片段的連接情況得出，片段與底物結合穩定性對連接率的影響遠低于TaqDNA連接酶的活性對它的影響。在20～65℃內連接率會隨著溫度升高而升高。

3.1 2種結構對連接率的影響

同一長度的片段在相同溫度下，結構Ⅰ的連接率明顯高于結構II的連接率。說明3’端突出的發卡結構的連接率明顯高于5’端突出的發卡結構的連接率。有研究指出5’-P端長度對連接率有較大影響，在一定范圍內5’-P端雙鏈越長連接率越高[17]。本研究結果顯示，結構I中作為連接底物的發卡結構5’-P端有8bp的雙鏈DNA結構，提供了足夠的與TaqDNA連接酶結合的空間，但是在結構II中，只有當5’-P化片段由6nt增長到8nt時連接率才會明顯提高。Doherty和Dafforn的研究指出T7 DNA連接酶可以連接5’-P端長7～9nt和3’-OH端長3～5nt的片段[18]。Chorella virus DNA連接酶可以結合5’-P端長11～12nt和3’-OH端長8～9nt的片段[19]。T4 DNA連接酶以非對稱的方式結合在存在缺口的封端雙鏈DNA上，最短可以結合5’-P端長6nt和3’-OH端長5nt的DNA[17]。由此得出以ATP為輔酶的連接酶與底物結合，需要在5’-P端長度長于3’-OH端時才能進行。同時本研究結果顯示以NAD+為輔酶的TaqDNA連接酶，在一定范圍內5’-P端雙鏈越長連接率越高。其次，由于TaqDNA連接酶更容易使結構I的DNA腺苷?；?，而結構II的單鏈DNA很難同TaqDNA連接酶和NAD+作用生成中間體，從而結構I連接效率明顯高于結構II連接效率。

3.2 片段長度、溫度和PEG 6000對連接率的影響

酶的活性、片段與底物的結合穩定性是影響連接率的主要因素。5nt片段無法連接，可能是片段太短，缺乏連接酶與連接片段緊密結合的位點，導致無法連接；6nt長的片段連接率很低，可能是片段太短酶很難識別，也有可能是片段與底物結合太不穩定從而導致連接率很低；隨著片段增長，片段與底物結合穩定性增強，從而連接率升高；酶的活性隨溫度升高(20～65℃)而升高，溫度升高連接率也不斷升高。

5～10nt片段與發卡結合用引物設計軟件Primer Premier 6.0估算其Tm值大約是19.2～35.2℃，即在20～35℃時片段與發卡底物才能結合的較穩定。但研究結果顯示20℃時6～10nt片段與發卡底物結合較穩定，但其連接率遠低于65℃時底物與發卡底物結合不穩定時的連接率。結果顯示，溫度越高反而連接率越高，而且在20℃時TaqDNA連接酶的活性明顯低于65℃，由此說明酶活性對連接率的影響要明顯高于片段與底物結合穩定性的影響。

6～7nt片段中加入PEG后連接率升高，原因可能是：(1)PEG的存在會使連接酶或酶與底物復合物穩定性增強：(2)由于大分子的簇擁作用，促進短片段和發卡底物與酶的相互作用。本研究發現底物結合穩定性對連接率的影響并不是很大，所以對于較易連接的8～10nt片段，加入PEG后促進作用顯著下降，甚至有一定的抑制作用。Pheiffer和Zimmerma曾指出在大分子的作用下如PEG 6000可以促進黏性末端和平末端DNA的連接[20]。Hayashi等人也發現PEG 6000既能促進分子間連接又能促進分子內連接[21]。而本研究的結果顯示PEG可能還有一定的抑制作用，這與已有的研究不同，可能原因是之前研究都是在底物復合物較穩定的情況下進行的，而本研究是在底物復合物不穩定的條件下進行的。

綜上所述，在高溫下與發卡底物結合不穩定的短片段也能連接，且在一定范圍內(20～65℃)連接率隨溫度升高而升高。片段長度，PEG和連接位點的結構特性對連接率也有很大影響。更高溫度(75℃甚至80℃)下TaqDNA連接酶的活性更高，溫度升高后錯配結合的可能性降低，從而使TaqDNA連接酶在檢測遺傳疾病、病原體和病毒等方面有更加廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1]Timson D J, Singleton M R, Wigley D B. DNA ligases in the r-epair and replication of DNA[J]. Mutation Research/DNA Repair, 2000, 460(3): 301-318.

[2]Gumport R I, Lehman I. Structure of the DNA ligase-adenylate i-ntermediate: Lysine-(ε-amino)-linked adenosine monophosphoramid-ate[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1971, 68(10): 2559-2563.

[3]Weiss B, Richardson C C. Enzymatic breakage and joining of de-oxyribonucleic acid III. An enzyme-adenylate intermediate in the polynucleotide ligase reaction[J]. Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(18): 4270-4272.

[4]Becker A, Lyn G, Gefter M, et al. The enzymatic repair of DNAII. Characterization of phage-induced sealase[J]. Proceedings of th-e National Academy of Sciences of the United States of America, 1967, 58(5): 1996-2003.

[5]Modrich P, Anraku Y, Lehman I. Deoxyribonucleic acid ligase is-olation and physical characterization of the homogeneous enzyme fromEscherichiacoli[J]. Journal of Biological Chemistry, 1973, 248(21): 7495-7501.

[6]Yudelevich A, Ginsberg B, Hurwitz J. Discontinuous synthesis of DNA during replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1968, 61(3): 1129-1136.

[7]易萍, 李力, 陳竹欽. DNA連接酶及相關檢測技術研究進展[J]. 中國優生與遺傳雜志, 2007, 15(8): 5-9.

Yi P, Li L, Chen Z Q. Research progress for DNA ligase and related detection technology[J]. Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 2007, 15(8): 5-9.

[8]Kuhn H, Frank-Kamenetskii M D. Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase[J]. FEBS Journal, 2005, 272(23): 5991-6000.

[9]Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase[J]. Proceedings of the National Acade-my of Sciences of the United States of America, 1991, 88(1): 189-193.

[10]Takahashi M, Yamaguchi E, Uchida T. Thermophilic DNA ligase. Purification and properties of the enzyme fromThermusthermop-hilusHB8[J]. Journal of Biological Chemistry, 1984, 259(16): 10041-10047.

[11]Nilsson M, Antson D O, Barbany G, et al. RNA-templated DNA ligation for transcript analysis[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(2): 578-581.

[12]Rossi R, Montecucco A, Ciarrocchi G, et al. Functional character-ization of the T4 DNA ligase: A new insight into the mechanism of action[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(11): 2106-2113.

[13]Cherepanov A V, de Vries S. Binding of nucleotides by T4 DNA Ligase and T4 RNA Ligase: Optical absorbance and fluorescence studies[J]. Biophysical Journal, 2001, 81(6): 3545-3559.

[14]Hirao I, Nishimura Y, Tagawa Y, et al. Extraordinarily stable mini-hairpins: electrophoretical and thermal properties of the various sequence variants of d (GCGAAAGC) and their effect on DNA s-equencing[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 20(15): 3891-3896.

[15]Antao V P, Lai S Y, Tinoco I. A thermodynamic study of unusu-ally stable RNA and DNA hairpins[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(21): 5901-5905.

[16]Berkner K, Folk W R. Polynucleotide kinase exchange reaction: quantitave assay for restriction endonuclease-generated 5'-phosphor-oyl termini in DNA[J]. Journal of Biological Chemistry, 1977, 252(10): 3176-3184.

[17]Ng P S, Bergstrom D E. Protein-DNA footprinting by endcapped duplex oligodeoxyribonucleotides[J]. Nucleic Acids Research, 2004, 32(13): 107-113.

[18]Doherty A J, Dafforn T R. Nick recognition by DNA ligases[J]. Journal of Molecular Biology, 2000, 296(1): 43-56.

[19]Odell M, Shuman S. Footprinting of Chlorella Virus DNA ligase bound at a nick in duplex DNA[J]. Journal of Biological Chemis-try, 1999, 274(20): 14032-14039.

[20]Zimmerman S B, Pheiffer B H. Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver orEscherichiacoli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1983, 80(19): 5852-5856.

[21]Hayashi K, Nakazawa M, Ishizaki Y, et al. Regulation of interand intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol[J]. Nucleic Acids Research, 1986, 14(19): 7617-7631.

責任編輯朱寶象

Investigation of the Ligation Characteristics ofThermusaquaticusDNA Ligase

YU Xin, WANG Jing, AN Ran, LIANG Xing-Guo

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：Background: DNA ligation is significant for both molecular biology and biotechnology. The ligation detail of T4 DNA ligase has been well studied and found that ligation can occur even when mismatched base pairs are present. Such scenario should be avoided when T4 DNA ligase is used for sequence specific DNA detection in which only positive result is expected for full matched case. On the other hand, the ligation characteristics of Thermus aquaticus (Taq) DNA ligase have not been studied in detail, especially for the temperature dependence. To further investigate the mechanism of Taq DNA ligase for the development of new biotechnologies using DNA ligation, here we used thermal stable DNA hairpin containing a 11 nt overhang and another single-stranded DNA as substrates to evaluate the effect of fragment length, temperature, structure of ligation sites, polyethylene glycol (PEG) concentration on DNA ligation by Taq DNA ligase . Results and Discussion: The results showed that structure of ligation substrates affected DNA ligation greatly. The yield of ligation between short DNA and hairpin I with 3' overhang was much higher than that between hairpin II with 5' overhang and short DNA with 5'-phosphate. Interestingly, 6 nt short DNA could be ligated to both hairpin structures although the efficiency was not high. The difference in ligation efficiency may be caused by the differences of forming ligation intermediate attaching AMP. Usually, 12 nt sticky ends are suggested to be used as ligation substrate, but we found 7 or 8 nt DNA could be ligated efficiently. This finding facilitated the molecular design of DNA detection technology. The ligation yield increased gradually with the increase of temperature from 20 to 65℃. Even for 8 or 9 nt short DNA which forms duplex (with its complementary sequence) with a Tm as low as 30℃, unexpectedly, the ligation efficiency was higher at 65℃than that at 45 or 55℃. This demonstrated that the complex of DNA ligase and 5’-phosphate substrate could help the hybridization. Even at 70 or 75℃, the 9 nt single stranded DNA could still ligate to the substrate, although the efficiency became lower. It is obvious that the mismatched substrate should be difficult to be ligated. The results also revealed that PEG 6000 improved the ligation of short fragments (6～7 nt) but not long ones (8～10 nt). Conclusions: Surprisingly, Taq DNA ligase could ligate a single-stranded DNA as short as 6 nt. Even for DNA as short as 8～9 nt, higher temperature (>65℃) gave higher yield of ligation. Structure Hp-I was found to be a better substrate because it has 5'phosphate, and could form the intermediate with Taq DNA ligase. These results are significant for developing DNA detection technology based on DNA ligation.

Key words:Taq DNA ligase; hairpin; short fragment

基金項目：? 山東省自然科學杰出青年基金項目(JQ201204)；國家自然科學基金項目(31201327)資助

收稿日期：2015-02-17；

修訂日期：2015-05-09

作者簡介：于欣(1990-)，女，碩士生，研究方向：生物工程。E-mail:yuxinhello2008@163.com ??通訊作者： E-mail:liangxg@ouc.edu.cn

中圖法分類號：Q783.2

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)05-050-06

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150057

Supported by Fund for Distinguished Young Scholars of Shandong Province (JQ201204); The National Natural Science Fund (31201327)