采用6個微衛星位點研究6個綿羊品種遺傳多樣性

陳李鵬 黃勇富 趙永聚 俄廣鑫 娜日蘇

（西南大學動物科技學院，重慶 400716）

采用6個微衛星位點研究6個綿羊品種遺傳多樣性

陳李鵬 黃勇富 趙永聚 俄廣鑫 娜日蘇

（西南大學動物科技學院，重慶 400716）

利用6個微衛星座位對中國烏珠穆沁羊、小尾寒羊、灘羊、昭通綿羊、呼倫貝爾羊和甘肅高山細毛羊6個綿羊品種，共計280個個體進行遺傳多樣性分析。計算了6個綿羊品種間的多態信息含量、雜合度和遺傳距離，并進行了主成分分析和UPGMA聚類。發現了101個等位基因，平均雜合度0.599-0.691，平均多態信息含量0.609-0.680；甘肅高山細毛羊與其他綿羊品種遺傳分歧最大，而呼倫貝爾羊與烏珠穆沁羊間的分歧最小。結果表明6個綿羊品種均具有較高的遺傳多樣性，品種間的遺傳關系與其形成歷史、分化及地理分布基本一致。

微衛星；遺傳多樣性；綿羊

我國地方綿羊品種眾多，遺傳資源十分豐富，是世界少有的寶貴基因庫［1］，但受世界范圍內商業品種的沖擊，導致市場競爭力低的地方品種逐漸走向衰落。因此，對中國綿羊品種遺傳多樣性進行評估和保護，已是當務之急。

微衛星又稱簡單串連重復序列，一般由2-6 bp組成核心序列，重復10-20次，首尾相接而組成［2］。它廣泛存在于真核生物的基因組中，可通過PCR擴增和電泳分型，具有數量多、多態性豐富、保守性好、共顯性遺傳以及檢測方便快速等優點［3-5］，在度量品種遺傳多樣性、估測品種間遺傳距離及構建系統發生樹等研究中顯示出巨大的優勢。目前，有很多學者應用微衛星DNA標記技術對綿羊的遺傳多樣性進行了研究。如Sun等［6］利用15個微衛星標記評估了5個綿羊品種的遺傳多樣性，結果表明群體遺傳結構與群體間的遺傳距離不一致。Agaviezor等［7］利用15個微衛星標記分析了4個尼日利亞綿羊品種共384只綿羊的遺傳多樣性，結果表明綿羊品種內遺傳變異高于品種間遺傳變異。Yilmaz等［8］利用18個微衛星標記分析了9個綿羊品種的遺傳多樣性，發現歐洲綿羊品種的遺傳變異高于土耳其綿羊品種；Leroy等［9］利用21個微衛星標記分析了49個綿羊品種的遺傳多樣性，評估了法國部分綿羊品種的起源分化模式。?urkovi?等［10］利用30個微衛星分析了18個綿羊品種的遺傳多樣性，評估了綿羊品種形成過程中自然和人工選擇的重要性。

本研究選取呼倫貝爾羊、烏珠穆沁羊、小尾寒羊、灘羊和昭通綿羊等5個中國地方綿羊品種，以及甘肅高山細毛羊1個培育品種，在常染色體基因組水平上研究6個微衛星位點的遺傳多樣性和遺傳分化關系，旨在為揭示其品種遺傳結構和遺傳背景，以及下一步開展資源保護與開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣本 本實驗樣本采自6個綿羊品種分布的主產區，每個品種隨機采集無親緣關系個體40只或48只，共計280只。所采血樣為8-10 mL/只，用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃凍存。各品種的樣本信息，見表1。

表1 6個綿羊品種的樣本信息

1.1.2 微衛星引物 根據相關微衛星選擇標準，并綜合考慮微衛星位點在染色體中位置、引物序列組成特點、微衛星位點多態性和產物大小等多方面因素，最后確定了分布于5條不同常染色體上的6對微衛星引物，分別為 OarJMP29、OarAE129、MCM-527、ILSTS005、MAF209和OarFCB304（表2）。

表2 6個微衛星位點的信息

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用基因組DNA提取試劑盒提取全血中的基因組DNA，-20℃保存。

1.2.2 PCR擴增 采用20 μL反應體系，其中各組分的終濃度分別為dNTPs 0.2 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、D NA模板1 μL（約60 ng）。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50-60℃退火30 s，72℃延伸30 s，經過35個循環；于72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物用ABI 3130 xl全自動基因分析儀進行分型檢測，片段分析的上樣操作參照曾盛誠［11］的文獻報道。

1.2.3 數據的統計處理 利用Microsatellite Toolkit軟件計算各微衛星座位的等位基因數、多態信息含量（PIC）、觀察雜合度（HO）和期望雜合度（HE）等參數［12］，Arlequin 3.5.1.3軟件計算6個品種間遺傳距離（DS）［13］，GENEPOP 3.4軟件進行哈德溫伯格平衡檢驗［14］，Fstat 2.9.3.2軟件計算群體近交系數（FIS）［15］，MVSP3.1軟件進行品種間遺傳分化的主成分分析和UPGMA聚類分析［16，17］。

2 結果

2.1 等位基因分布

6個綿羊品種微衛星座位的等位基因分布見表3。由表3可見 ，在OarFCB304座位檢測到的等位基因數最多，達到24個，OarAE129座位檢測到的等位基因數最少，為9個，6個綿羊品種在6個微衛星座位中共檢測到101個等位基因，平均每個座位的等位基因數為16.8；同一個微衛星座位，在不同品種間的等位基因分布也不同，如在OarJMP29座位上，UQ、ZT、HBR、STH、TAN、GSH檢測到的等位基因數分別為10、9、11、8、9、7。

表3 6個微衛星座位在6個綿羊品種中的等位基因數

2.2 品種內的遺傳變異檢測

2.2.1 觀測雜合度和期望雜合度 6個綿羊品種的觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）的檢測結果見表4。就座位而言，MAF209 座位的平均HO最高，達到0.764；OarAE129 座位的平均HO最低。就品種而言，6個綿羊品種的群體雜合度均較高，除ZT的HO為0.599外，其余都在 0.6-0.7之間，屬于高度雜合群體。

2.2.2 多態信息含量（PIC） 由表4可知，就座位而言，6個微衛星座位平均PIC值在0.505-0.755 之間，表現為高度多態，MCM527座位平均PIC值最大，達到 0.755。表明所選6個微衛星標記均具有較高的多態性，能夠提供大量的遺傳信息，可作為有效的分子遺傳標記用于群體遺傳多樣性分析。就品種而言，6個綿羊品種PIC均高于0.5。GSH為培育品種，平均PIC值為0.672，其余5個地方綿羊品種平均PIC值在0.609-0.680間分布，表明這6個綿羊品種的遺傳多樣性較高，具有很高的育種潛力。

2.2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗 本研究中Hardy-Weinbery 平衡檢驗結果（表5）顯示，GSH在2個基因座處于哈溫不平衡、其余5個綿羊品種均在1個基因座處于不平衡狀態。

2.2.4 群體內近交系數 6個綿羊品種的近交系數（FIS）測定值（表6）顯示，6個綿羊品種的FIS范圍是0.041-0.166，6個微衛星位點的平均FIS值在-0.005-0.254 7之間，矯正后的P值為0.001 4，除ZT的P值與校正后的P值相同外，其余5個品種的P值都大于校正后的P值，顯示近交程度不明顯。ZT的FIS值最大（FIS=0.166），其近交程度較高，通過校正其近交系數顯著偏離0，這可能與尚未建立ZT的保護區和保種場和處于農戶自繁自養狀態有關。

2.3 品種間的遺傳關系

2.3.1 遺傳距離 基于SSR數據計算了6個綿羊品種間的Nei氏標準遺傳距離（DS），結果見表7。由表7可見，UQ、ZT、HBR、STH和TAN 5個地方品種之間遺傳距離在0.012-0.156之間，HBR與UQ遺傳距離最小，STH與UQ和HBR兩個品種間的遺傳分歧較小，GSH與其他5個地方品種之間的遺傳距離均較大。

表 4 6個綿羊品種在6個微衛星位點上的遺傳變異參數

表5 哈溫平衡檢測各品種各基因座P值

2.3.2 聚類分析 主成分分析是揭示群體間遺傳分化程度和遺傳關系的一種聚類方法，研究群體間在多個標記座位上的差異性，具有多變量的特征［18］?；谖⑿l星數據，利用MVSP3.1軟件進行了主成分分析，結果如表8所示，在5個主成分中前3個主成分累計貢獻率達到76.795%，足以代表原始因子的大部分信息，據此繪制主成分分析散點圖（圖1）。其中第1主成分、第2主成分和第3主成分分別占總變異的38.02%、23.19%和15.58%。

在前3個主成分中，第1主成分將GSH與其他5個地方品種分開；第2主成分將ZT從5個地方品種中分出；第3主成分將UQ、HBR和STH分為一類，與TAN分開。同樣利用MVSP3.1軟件進行了UPGMA聚類分析，結果如表9所示，據此得到聚類圖（圖2），與主成分分析結果基本一致。

表 6 六個綿羊品種的近交系數

表7 6個綿羊品種間的遺傳距離

表9 UPGMA聚類結果

表8 MVSP主成分分析結果

3 討論

3.1 遺傳多樣性和遺傳分化分析

本研究所用的6個微衛星座位在6個綿羊品種中均檢測到9個以上等位基因，各座位的多態信息含量都很高。根據Bolstein等［19］提出的基因變異程度衡量指標，本研究涉及的6個微衛星座位均屬高度多態基因座。因此，初步認為這6個微衛星標記是普遍適合于綿羊遺傳分化的多態標記。

多態信息含量（PIC）是群體內遺傳變異的量度指標，可用來描述微衛星位點的變異程度。Ma等［20］利用30個微衛星標記分析了12個地方綿羊品種的遺傳多樣性，平均PIC在0.519-0.666之間；儲明星等［21］利用2個微衛星標記對5個綿羊品種的研究結果得出平均PIC為0.60；本研究中6個微衛星均為高度多態，其中以MCM527的多態性最高，為0.755。

雜合度又稱基因多樣性，反映群體在多個位點上的遺傳變異。一般認為它是度量群體遺傳變異的一個重要參數。本實驗所選取的6個微衛星平均HE在0.544-0.795之間，6個綿羊品種的平均HO為0.599-0.691，表明這6個綿羊品種具有豐富的遺傳變異和較高的遺傳多樣性。呂慎金等［22］利用30個微衛星標記得出8個綿羊群體的平均雜合度為0.539-0.714。儲明星等［23］用5個微衛星標記揭示的STH平均雜合度為0.456 9，而本研究中6個微衛星標記得到STH的平均雜合度為0.671，表明本研究中所選擇的微衛星座位具有較高的多態性。

圖 1 6個綿羊品種前3個主成分的三維散點圖

圖 2 6個綿羊品種間的UPGMA聚類圖

微衛星DNA本身是選擇中性的，不受選擇的壓力，因此在一個理想群體中各等位基因在群體中的分布頻率應該是穩定的［24］。通過哈代溫伯格平衡檢驗6個座位，發現MAF209、OarJMP29和OarFCB304三個座位在6個品種都處于平衡狀態，ILSTS005座位在GSH偏離平衡，MCM527座位在ZT和GSH偏離平衡，OarAE129在UQ、HBR、STH和TAN等4個品種中偏離哈代溫伯格平衡。

3.2 遺傳距離和聚類分析

該研究通過Arlequin軟件計算得到了Nei 氏標準遺傳距離，應用MVSP 3.1進行了主成分分析和UPGMA聚類。通過這兩種方法，發現6個綿羊品種間的聚類結果與遺傳距離基本一致。一般認為群體分化時間越短，遺傳距離越小，HBR、UQ、STH和TAN等4個本地品種之間的遺傳距離較小，ZT與這4個品種之間的遺傳距離相對較大。而培育品種GSH與5個地方品種遺傳距離均較大，獨自聚為一類，聚類結果與品種的形成史、分化及地理分布基本一致。如HBR與UQ遺傳距離最小，首先聚為一類，它們均來自內蒙古，生活環境極為相似，均是在當地長期的自然和人工選擇情況下而逐漸育成的肉脂兼用型綿羊品種［25］。GSH是從1950年開始，采用復雜育成雜交方法進行培育，于1981年育成的培育品種［26］，與其他5個地方綿羊品種遺傳距離最大，親緣關系較遠。

HBR、UQ、STH和TAN等4個品種均隸屬于蒙古羊系統，起源于共同的祖先群體而親緣關系相對較近，有相關研究也證實了這一觀點。如仲濤等［27］采用21個微衛星座位，運用DA遺傳距離將9個地方綿羊品種進行了分類，其中屬于蒙 古羊系的UQ、HBR、TAN和湖羊聚 為一類。郭小雅等［28］分析了我國6個綿（山）羊品種的遺傳分化，進一步證明了UQ和STH、TAN、湖羊、同羊有較近的親緣關系，共同歸屬于“蒙古羊”系。任春環等［29］分析了5個綿羊品種的遺傳多態性，結果表明TAN與STH的親緣關系較近。馬月輝等［1］采用30個微衛星標記，對12個中國地方綿羊品種和一個外來品種進行遺傳多樣性研究，發現蘇尼特羊和UQ首先聚為一類，TAN和STH聚為一類，然后這4個品種作為一個分支聚為一類。本研究中TAN與STH遺傳距離較小為0.076，STH與UQ遺傳距離最小為0.040，本研究中僅用了6個微衛星位點分析6個綿羊品種遺傳多樣性，但與先前研究結果基本一致，說明本研究采用的6個高度多態微衛星在一定程度上能夠反映綿羊群體的遺傳結構。

昭通綿羊的起源有可能是云南本土或是由西藏的野生綿羊馴化而來［27］。蘭蓉等［30］對云南綿羊進行了線粒體DNA和血液蛋白多態性研究，結果發現昭通綿羊和印度綿羊、尼泊爾綿羊關系較近，而與西藏綿羊關系較遠，但其起源還有待于深入研究。仲濤等［31］對中國部分綿羊品種的遺傳多樣性進行了研究，表明昭通綿羊與其他藏系綿羊間遺傳分化較明顯，支持了昭通綿羊起源于云南本土的說法。婁淵根等［32］認為昭通綿羊因位于云貴高原，地理隔離阻礙了其與其他品種的基因交流，使其在分類上自成一類。本研究中昭通綿羊與其他5個綿羊品種遺傳距離較大，主成分分析和聚類分析也得到相同的結果，研究結果支持昭通綿羊起源于云南本土的說法。

4 結論

本研究選用的6個微衛星為高度多態性位點，在一定程度上可以反映綿羊群體的遺傳結構。通過微衛星標記分析發現6個綿羊品種具有豐富的遺傳變異和較高的遺傳多樣性。品種間遺傳距離分析、主成分分析及UPGMA聚類，結果均一致說明培育品種GSH與其他5個地方品種的遺傳分歧最大，HBR與UQ遺傳分歧最??；STH、TAN、HBR和UQ共同歸屬于蒙古羊系，親緣關系相對較近，進一步證實了STH與TAN親緣關系較近的說法，各綿羊品種間的遺傳關系與其形成史、分化及地理分布基本一致，昭通綿羊與其他綿羊品種間的遺傳距離較大，支持了其起源于云南本地的觀點。

致謝：感謝中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所馬月輝研究員、四川農業大學動物科技學院仲濤副研究員在樣品采集中給予的幫助。

［1］馬月輝, 呂慎金, 侯冠或, 等. 中國部分綿羊品種遺傳多樣性研究［C］//中國畜牧獸醫學會養羊學分會全國養羊生產與學術研究會議論文集. 中國草食動物雜志出版社, 2005.

［2］岳遠瑞, 袁曉航, 周路, 等. 新疆7個綿羊品種MHC區段微衛星遺傳多樣性的分析［J］. 石河子大學學報：自然科學版, 2014, 32（4）：438-443.

［3］Botstein D, White RL, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］. Am J Hum Genet, 1980, 32：314-331.

［4］Lumsden JM, Loard EA, Montgomery GW. Characterisation and linkage mapping of ten microsatellite markers derived from a sheep x hamster cell hybrid［J］. Animal Genetics, 1996, 27：203-206.

［5］Chen HJ, Yue YS, Fan XZ, et al, Study comparatively on genetic distance and genus analysis measures in Shandong indigenous chicken breeds［J］. Journal of Farming and Veterinarian, 2004, 35（1）：33-36.

［6］Sun W, Chang H, Tsunoda K, et al. Analysis of geographic and pairwise genetic distances among sheep populations［J］. Biochem Genet, 2010, 48（5-6）：376-84.

［7］Agaviezor BO, Peters SO, Adefenwa MA, et al, Morphological and microsatellite DNA diversity of Nigerian indigenous sheep［J］. Anim Sci Biotechnol, 2012, （1）：38.

［8］Yilmaz O, Cemal I, Karaca O. Genetic diversity in nine native Turkish sheep breeds based on microsatellite analysis［J］. Anim Genet, 2014, 45（4）：604-608.

［9］Leroy G, Danchin-Burge C, Palhière I, et al. How do introgression events shape the partitioning of diversity among breeds：a case study in sheep［J］. Genet Sel Evol, 2015, 47（1）：48.

［10］?urkovi? M, Ramljak J, Ivankovi? S, et al. The genetic diversity and structure of 18 sheep breeds exposed to isolation and selection［J］. J Anim Breed Genet, 2016, 133（1）：71-80.

［11］曾盛誠. 利用20個微衛星標記分析國內外11個雞群體的遺傳多樣性［D］. 北京：中國農業科學院, 200 9.

［12］Park SDE. Trypanotolerance in West African Cattle and thepopulation genetic effects of selection［D］. Dublin：University of Dublin, 2001.

［13］Excoffier L, Lischer HEL. Arlequin 3.5：A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows［J］. Molecular Ecology Resources, 2010, 10：564-567.

［14］Raymond M, Rousset F. GENEPOP（Version 1. 2）：population genetics software for exact tests and ecumenicism［J］. Journal of Heredity, 1995, 86（3）：248-249.

［15］Goudet J. STAT（Version 1. 2）：A computer program to Calculate F-Statistic［J］. J Hered, 1995, 86：485-486.

［16］Nei M, Li WH. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76：52-69.

［17］Nei M, Li WH. Analysis of gene diversity in subdivided populations［J］. Proc Nat l Acad Sci USA, 1973, 70：3321-3323.

［18］常爽. 9個綿羊群體遺傳多樣性的微衛星分析［D］. 鄭州：河南農業大學, 2010.

［19］Botstein D, White RL, Skolnick MH, Davis R. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］. Am J Hum Genet, 1980, 32：314-331.

［20］Ma YH, R ao SQ, Lu SJ, et al. Phylogeography and origin of sheep breeds in Northern China［J］. Conservation Genetics, 2006, 7（1）：117-127.

［21］儲明星, 程金華, 過緯. 微衛星標記OarAE101和BM1329在五個綿羊品種中的初步研究［J］. 遺傳學報, 2001, 28（6）：510- 517.

［22］呂慎金, 楊燕, 候冠玉, 等. 運用微衛星標記對中國地方綿羊品種的遺傳多樣性分析［J］. 畜牧獸醫學報, 2008, 7：858-865.

［23］儲明星, 王吉振, 王愛國, 等. 小尾寒羊五個微衛星基因座遺傳多態性研究［J］. 遺傳學報, 2002, 29（6）：502-506.

［24］李延璐. 7個綿羊群體15個微衛星DNA座位遺傳多樣性分析［D］. 合肥：安徽農業大學, 2009.

［25］趙有璋. 中國養羊學［M］. 北京：中國農業出版社, 2011.

［26］杜立新. 中國畜禽遺傳資源志. 羊志［M］. 北京：中國農業出版社, 2011.

［27］仲濤, 馬月輝, 關偉軍, 等. 10 個綿羊品種的微衛星 DNA 多態性研究［J］. 畜牧獸醫學, 2008, 39（5）：555-561.

［28］郭小雅, 楊章平, 常洪, 等. 13我國6個綿（山）羊群體遺傳分化的微衛星分析［J］. 畜牧與獸醫, 2007, 39（5）：16-20.

［29］任春環, 張子軍, 吳建平, 等. 5個綿羊群體微衛星標記的遺傳多態性分析［J］. 安徽農業大學學報, 2010, 37（3）：436-439 .

［30］蘭蓉, 洪瓊花, 張俊, 等. 云南不同地區綿羊血液蛋白多態性研究［J］. 草食家畜, 2002, 3（1）：43-47.

［31］仲濤. 中國部分綿羊品種的遺傳多樣性研究［D］. 北京：中國農業科學院, 2007.

［32］婁淵根, 劉丑生, 劉建學, 等. 9個綿羊品種微衛星DNA遺傳多樣性分析［J］. 中國畜牧獸醫, 2011, 38（10）：106-112.

（責任編輯 李楠）

The Genetic Diversity of Six Chinese Sheep Breeds by Six Microsatellite Markers

CHEN Li-peng HUANG Yong-fu ZHAO Yong-ju E Guang-xin NA Ri-su
（College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400716）

Six microsatellite loci were used to analyze the genetic diversity of 280 sheep from 6 Chinese bre eds of Ujumqin sheep，Smalltailed Han sheep，Tan sheep，Zhaotong sheep，Hulun Buir sheep，and Gansu Alpine Merino. We calculated the polymorphism information content，heterozygosity and genetic distance，analyzed the principal components and clustered UPGMA from these 6 sheep breeds. Altogether，101 alleles were found，the mean heterozygosity was 0.599-0.691，and mean polymorphism information content was 0.609-0.680. The Gansu Alpine Merino sheep had the most genetic divergence compared to other sheep breeds，while the Hulun Buir and Ujumqin ones were the least in genetic divergence. The above results showed that these 6 breeds had relatively high genetic diversity，and their genetic relationships were consistent with their formation history，differentiation and geographical distribution.

microsatellite；genetic diversity；sheep

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.012

2015-07-28

中央高?；究蒲袠I務費專項資金（SWU114023）

陳李鵬，男，碩士，研究方向：動物遺傳；E-mail：clpshanxi@126.com

黃勇富，男，研究員，研究方向：動物遺傳多樣性、遺傳資源評價與創新利用；E-mail：hyf65@163.com