溶磷菌對鉛脅迫下杏鮑菇氧化應激反應的影響

何難徐恒

（1.成都中醫藥大學醫學技術學院，成都 611137；2.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都 610064）

溶磷菌對鉛脅迫下杏鮑菇氧化應激反應的影響

何難1，2徐恒2

（1.成都中醫藥大學醫學技術學院，成都 611137；2.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都 610064）

選擇使用杏鮑菇菌絲富集重金屬Pb2+，從本實驗室菌種庫中篩選出了8株能抗800 mg/L Pb2+的菌株。通過對其溶磷能力的檢測，從中篩選到了2株溶磷能力較強的菌株CG8、FFT1以及2株溶磷能力較弱的菌株FFC6、FFC11，經16S rDNA序列分析鑒定，CG8為克雷伯菌（Klebsiella sp.），FFT1為假單胞菌（Pseudomonas sp.），FFC6和FFC11為芽孢桿菌（Bacillus sp.），其序列相似度均達99%。隨后，研究了4株溶磷菌株對液體培養（Pb）條件下杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌絲的生物量、Pb富集量、脂質過氧化、巰基蛋白含量和抗氧化酶的影響。結果顯示，在Pb脅迫條件下，具溶磷能力的菌株能在一定程度上增加菌絲生物量，促進菌絲對重金屬的富集，同時，使菌絲的丙二醛（MDA）含量降低，菌絲抗氧化酶（SOD）和氧化物酶（POD）活性顯著降低，菌絲巰基蛋白含量升高。實驗證明，微生物溶磷能力可有效減輕重金屬對杏鮑菇菌絲的毒害和重金屬誘導的氧化脅迫。并且溶磷能力較強的菌株（CG8）對杏鮑菇菌絲富集與抵抗重金屬誘導的氧化脅迫有更為明顯的作用，重金屬富集量增加96.1%，巰基蛋白增加量為91.3%。

蕈菌；重金屬；溶磷能力；抗氧化系統

現代社會工業技術的飛速發展也帶來了重大的環境污染問題。由于冶煉、化工、礦產、制革、電池、造紙、農藥等行業的興起與發展，越來越多的重金屬直接排入環境中，造成污染［1］。Pb正是其中一種毒性極強，污染范圍極廣的危險元素。大量無節制的污染排放大大提高了土壤中Pb濃度，據報道，我國眾多城市都存在著土壤鉛濃度超標的問題［2-4］。同樣的報道也表明了其他國家存在相同的Pb污染問題，植物的正常含Pb量為0.05-3 mg/kg，而世界土壤含Pb量通常在2-200 mg/kg之間，平均含Pb量為15 mg/kg，遠高于正常值［5］。作為高毒性重金屬，Pb對植物、動物以及人類都產生巨大的危害。鉛不僅會危害人體中樞神經系統，還會損害腎臟、肝臟、生殖系統、大腦功能和基本的細胞內反應［6］。因此，對土壤中Pb污染的治理，是當代環境污染研究治理的重點。對比傳統的物理及化學治理手段，生物修復具有更高效，更環保，更廉價的優勢，因此受到越來越多的關注與重視。1983 年美國科學家Chaney首次提出了能夠利用富集重金屬的植物來清除土壤重金屬污染的設想。至今已有多種生物被應用于土壤重金屬修復［7-9］。蕈菌作為大型真菌，對重金屬也有極強的耐受和富集能力。有研究表明，香菇等絲狀真菌對鈣、鋅、硒等元素有更高富集率［10-12］。

Pb作為非氧化還原金屬，無法參與芬頓反應，但會導致土壤中生物體形成活性氧（ROS），如過氧化氫、過氧化物、羥基自由基等［13，14］。而生物體細胞和組織針對氧化損傷，會利用酶或非酶機制，例如：氧化酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）以及谷胱甘肽等［15］。關于土壤中生物體對于鉛耐受而產生的氧化應激反應的研究也有許多。Wang等［16］對土壤Pb污染環境下，番茄幼苗抗氧化體系的丙二醛（MAD）、SOD變化進行研究，添加Pb后，發現O2-濃度升高，SOD兩個同工酶波段增加，以抵抗氧化損傷。陳蘭等［17］研究證明在Pb耐受狀態下，長根菇菌絲體CAT與SOD酶活性均有提高［1.131 U/g（Pb（Ⅱ），100 mg/L），13.976 U/g（Pb（Ⅱ），200 mg/L）］。

在土壤中，不溶性磷化合物可以被植物和微生物代謝產生的有機酸、可溶性磷酸酶和絡合劑所溶解［18］。如溶磷細菌（PSB）已表明可增強對不溶性磷化合物的溶解，并且已廣泛應用于增加磷吸收并提高作物產量之中［19］；PSB也可溶解部分難溶性重金屬磷酸鹽，使重金屬易于被提取，從而修復重金屬污染土地［20］。Jin等［21］對溶磷菌對土壤中Pb的固定化能力進行了研究，結果表明，其具有一定的重金屬修復能力。Seulki等［22］對比了未接種與接種PBS的芥菜與苘麻對Cd污染土壤的耐受能力，結果表明植株生物量由0.087 g上升到0.448 g。

本實驗從土壤中篩選出的抗高濃度Pb的細菌庫中選取4株具有不同溶磷能力細菌（PSB），重點討論溶磷菌溶磷能力的強弱對Pb脅迫條件下，杏鮑菇菌絲生物量、重金屬富集量、丙二醛（MDA，指示脂質過氧化程度的生物標記分子）含量、總巰基蛋白（TSH）和氧化酶體系（SOD、POD）含量的差異，研究其對實驗室模擬土壤條件下杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌絲的生長促進不同影響以及對鉛毒性的減輕作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 SLP液體培養基：1%蔗糖；0.1%（NH4）2SO4；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4；0.01% NaCl；0.05%酵母浸出物；pH7.2。若配置固體培養基則需要加入1%的瓊脂粉。

Pb抗性培養基：在SLP固體培養基中加入相應的Pb（NO3）2溶液即可。

蒙金娜無機固體培養基（檢測溶磷能力）：1%葡萄糖，0.03%氯化鈉，0.05%硫酸銨，0.003%七水合硫酸亞鐵，1%磷酸三鈣（研磨），0.003%四水合硫酸錳，0.04%酵母浸出物，1%瓊脂粉，pH7.2。

蒙金娜搖瓶培養基：以蒙金娜固體培養基不加入瓊脂粉即可。

PDA培養基：馬鈴薯煮沸濾液20%，葡萄糖2%，瓊脂1%，自然pH。

1.1.2 試劑 重金屬溶液：配制重金屬Pb（Pb（NO3）2）濃度為20 g/L的母液，高溫滅菌后閉光保存。

酶與蛋白等檢測溶液：1.0 mol/L Tris母液配制：1.0 mol/L pH8.2 Tris-Cl：12.11 g Tris（wm：121.14），3.8 mL濃鹽酸，調節pH至8.2，定容至100 mL。

10 mmol/L DTNB標準溶液（Ellman’s試劑）：準確稱取0.198 175 g DTNB用 50 mmol/L Na2HPO4（pH7.0）配制成50 mL溶液，存放于棕色瓶中，于暗處低溫保存備用。

0.2 mol/L PB母液（pH7.2）：0.2 mol/L NaH2PO425 mL，0.2 mol/L Na2HPO4，75 mL，即可配成100 mL pH7.2，0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液。

0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液母液（pH7.0）：配制0.2 mol/L KH2PO4溶液，用KOH調節pH7.0即可。

1.2 方法

1.2.1 鉛抗性及溶磷能力細菌的篩選 使用蔗糖-低磷酸鹽培養基（SLP）培養基，篩選實驗室重金屬抗性菌株細菌庫，得到8株高抗Pb性細菌（800 mg/L Pb）。

將分離獲得的菌株保存在斜面培養基上，活化2-3代，然后分別點接種于蒙金娜無機固體培養基，置于30℃培養箱中培養10 d，觀察有無溶磷圈以及溶磷圈大小，初步得到4株具有溶磷性的細菌菌株。

將上述4株細菌制成108cell/mL的菌懸液（OD660nm=0.5），取1 mL磷細菌液接種于30 mL搖瓶培養基中，對照組接1 mL無菌水，接種后160 r/min 28℃，振蕩培養6 d。培養好的磷細菌液在4℃ 離心（10 000 r/min）15 min，取上清液定容至50 mL，鉬藍比色法測定培養液中所含磷。沉淀經溶菌液處理，37℃水浴1 h，4℃離心（10 000 r/min）15 min，取上清液定容至50 mL，測定菌體吸收磷含量。

1.2.2 菌株鑒定 菌株鑒定均采用16S rDNA基因序列。菌落PCR采用LB液體培養基中活細胞直接作為模板序列，引物為細菌通用引物：27 f（5'-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3'）和1492 r（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）［23］。PCR體 系（50 μL）為：1 μL菌液，5 μL 10×PCR buffer（Mg2+），3 μL 25 mmol/L MgCl2，4 μL 2.5 mmol/L dNTP， 20 μmol/L上、下游引物各2 μL，0.25 μL 5 Taq DNA聚合酶和32.75 μL無菌水。PCR儀器型號為PTC-200，Bio-Rad，USA，PCR程序參照Jiang等［24］方法。PCR產物經DNA純化試劑盒（TaKaRa）純化后，送上海英駿生物技術公司測序。所得16S rDNA序列采用NCBI Blast程序與GenBank數據庫中序列進行比對。

1.2.3 菌絲培養 將4株溶磷菌制備為108cell/mL菌懸液，稀釋105倍后取0.1 mL加入50℃未凝固PDA液體中，待凝固后接種培養菌絲，并設置不同重金屬濃度以及不同溶磷菌種溶磷液培養組。24℃靜置培養20 d后，真空抽濾得菌絲體。其中一半烘干后測生物量干重與重金屬含量，另一半經液氮冷卻后檢測抗氧化酶類、MDA和總巰基含量。

1.2.4 菌絲金屬富集量檢測 菌絲經烘箱烘干后磨成粉末，用濃HNO3和30% H2O2（5∶2，V/V）進行微波消解，去離子水精確定容至25 mL后，用火焰原子吸收光譜法（AAS；VARIAN，SpectrAA-220Fs）測定Pb含量。

1.2.5 杏鮑菇SOD、POD、MDA以及TSH含量測定 杏鮑菇菌絲，先用去離子水洗凈，取 1 g，混合2 g石英砂，液氮研磨至白色微粉為止，用20 mmol/L Tris-EDTA（EDTA：1 mmol/L）懸浮，3.5 mL/1 g菌絲體（0.7 mL/0.2 g）。6 200×g，10 min，4℃，取上清（0.6 mL），17 000×g，（50+15）min，4℃，均取上清（0.55 mL，0.5 mL），0.45 μm濾膜過濾，冰上保存至使用。SOD酶活性檢測采用Beauchamp和Fridovich的方法［25］。POD酶活性檢測采用Omran的方法［26］。杏鮑菇MDA用硫代巴比氏酸（TBA）法［27］測定，通過檢測脂質過氧化反應的終產物MDA含量進行表征。MDA濃度由155 mM-1cm-1消光系數計算，單位為mmol/g鮮重。TSH含量采用Guimaraes等［28］的方法，其中待用溶液配制如上所述。

1.2.6 數據分析 對數據進行方差分析（ANOVA）后，采用Student-Newman-Keuls test（P<0.05）對包括對照組在內的各處理組進行均值比較，采用Dunnett t-test（2-sided，P<0.05）對處理組與對照組進行均值比較。包括相關性分析在內的所有的統計分析均在PASW Statistics 18.0上進行。

2 結果

2.1 鉛抗性及溶磷能力細菌的篩選

共篩選出4株具有不同溶磷能力及具有鉛抗性的細菌（CG8、FFT1、FFC6、FFC11），菌株提取16S DNA測序后，BLAST對比鑒定親緣性，結果（表1）顯示，菌株CG8為克雷伯菌（Klebsiella sp.），FFT1為假單胞菌（Pseudomonas sp.），FFC6和FFC11均為芽孢桿菌（Bacillus sp.），其序列相似度均達到99%。

表1 菌株鑒定及其溶磷量

2.2 溶磷菌對杏鮑菇菌絲生長的影響

Pb脅迫下，添加與未添加PSB的杏鮑菇菌絲生長結果（表2）顯示，溶磷菌對杏鮑菇菌絲的生長有一定程度的促進作用。其中CG8在低濃度P b（50 mg/L）與高濃度Pb（100 mg/L）環境下都表現出最強的促進作用，分別提高了35.8%和9.7%的生物量。而且所有溶磷菌均在較低濃度Pb（50 mg/L）環境下表現出更強的促生長作用。

表2 溶磷菌對杏鮑菇菌絲生長的影響

2.3 溶磷菌對杏鮑菇菌絲富集Pb能力的影響

檢測添加與未添加PSB杏鮑菇菌絲富集Pb的含量，結果（表3）顯示，在溶磷菌影響下的杏鮑菇菌絲具有更強的Pb富集能力。其中CG8表現出最強的增強效果，在低濃度Pb（50 mg/L）與高濃度Pb（100 mg/L）環境下分別對杏鮑菇對Pb的富集量提高了96.1%和110.6%。而在高濃度Pb（100 mg/L）環境下各溶磷菌對杏鮑菇菌絲對Pb富集效果的提高表現更佳。

表3 溶磷菌對杏鮑菇菌絲富集Pb能力的影響

圖1 溶磷菌對杏鮑菇菌絲MDA活性的影響

圖2 溶磷菌對杏鮑菇菌絲SOD活性的影響

2.4 溶磷菌對杏鮑菇菌絲MAD、SOD、POD、TSH的影響

本實驗中，菌絲在高濃度Pb（100 mg/L）脅迫下體內所含MDA含量高于低濃度（Pb 50 mg/L）脅迫下MDA含量。在溶磷菌輔助作用下，杏鮑菇菌絲體MAD含量比對照組顯著降低（圖1）。經溶磷菌處理的菌絲體MAD含量最高可降低52.9%（Pb 100 mg/L，CG8處理），最低也可降低14.2%（Pb 50 mg/L，FFC11處理）。圖2顯示，杏鮑菇菌絲體在溶磷菌影響下機體產生的SOD含量有明顯降低，其中CG8菌表現的能力最強，SOD含量分別降低44.2%（Pb 50 mg/L）及49.2%（Pb 100 mg/L）。圖3顯示，溶磷菌還有輔助機體降低POD的能力，POD含量最高可降低59.1%（Pb 100 mg/L，CG8處理）。同時溶磷菌還具有增強杏鮑菇機體產生巰基蛋白的能力（圖4）。

圖3 溶磷菌對杏鮑菇菌絲POD活性的影響

圖4 溶磷菌對杏鮑菇菌絲TSH活性的影響

3 討論

搖瓶培養基檢測出各菌株的溶磷量，結果表明4株菌株的溶磷能力由強到弱依次為CG8>FTT1> FFC6>FFC11。除FFC11外，與固體蒙金娜培養基上菌株所產生溶磷圈的結果基本一致。FFC11在蒙金娜固體培養基上基本不產生溶磷圈，而在液體振蕩培養中表現了一定的溶磷能力，這可能與兩種培養的方式和過程不同有關。

實驗表明在溶磷菌協同生長情況下，杏鮑菇生物量有所提高。并且在Pb離子濃度較低的情況下對菌絲生長的促進作用更強。同樣，針對溶磷菌對作物生長的促進能力的報道也有很多，如溶磷菌對柑桔生物量有較大的影響，菌種處理過的植株地上部分鮮重的增長量可達21.6 g，而接種溶磷菌可使苜蓿株高、莖粗、干重、干鮮比和葉莖比都比對照明顯增加［29，30］。溶磷菌促植株生長可能與能釋放難溶性磷使植株得到有效營養有關［31］；也有報道稱與其改善植株營養后增加了植株跟吸收率，能有效獲得更多營養元素有關［32］。

溶磷菌影響下的杏鮑菇菌絲具有更強的Pb富集能力，這可能與溶磷菌增強磷酸鹽誘發的金屬固定化能力有關［21］。Elena等［33］研究發現似歐石南屬植物菌根真菌由于具有溶磷能力，可增強對土壤中ZnO以及Zn3（PO4）2的溶解，從而提高植株對Zn的富集量。Fomina等［34］同樣發現菌根真菌可利用其增溶有毒重金屬的能力，提高其對礦物質中重金屬Cd、Cu、Pb、Zn等成分的吸收。但溶磷菌輔助下蕈菌和植物對重金屬的吸收機制還并不完全清楚，有待進一步研究。

生命體在受到重金屬或高溫等不利環境脅迫時，會產生活性氧自由基（ROS），如過氧化氫、超氧化物和羥基自由基，誘導體內的脂質過氧化反應［35-37］。MDA是脂質過氧化程度的指示物，其濃度越高，表明脂質過氧化程度越嚴重。本研究溶磷菌對杏鮑菇菌絲MDA活性影響結果表明重金屬濃度越高，生物體受到氧化脅迫越嚴重，從而氧化應激反應的指示物（如MDA）含量也會增加［38］。如前所述，PSB處理組中脂質過氧化程度越低，菌絲生長越好，所以其蛋白質含量明顯增加就顯得一點兒也不奇怪。

生物體中SOD是一種高效的活性氧自由基清除劑［39］，可以降解自由的超氧化物，轉化為過氧化氫和氧。而POD則以過氧化氫為電子受體，可催化底物氧化的酶，從而達到降解過氧化氫，減輕氧化損傷的目的。本實驗結果表明，溶磷菌能夠同時降低杏鮑菇菌絲體內SOD和POD的含量，并大致隨著細菌溶磷能力的增強而含量降低，可以說明PSB可能通過降低相關ROS酶類的活性來部分減輕重金屬誘導的氧化脅迫，從而引起SOD以及POD含量的降低。作為來源于SOD催化O2-生成的H2O2的清除劑，POD活性或升或降，這與重金屬種類、金屬濃度和受試物種有關［40，41］。盡管如此，培養基中存在PSB時，SOD和POD活性顯著下降。這些結果表明，在杏鮑菇菌絲體抗氧化反應中，SOD和POD扮演著重要的角色；同時，PSB可以通過降低相關酶類的活性來部分減輕重金屬誘導的氧化脅迫。

總巰基（TSH）在本實驗中表現出與以上幾種指標不太一致的變化特性。在Pb濃度高的環境下含量減少，并且在有溶磷菌影響的情況下，含量有升高的趨勢。這可能是因為，雖然巰基化合物在應對重金屬脅迫中起到積極的作用［42］，但由于重金屬對菌絲生長的影響，導致菌絲體的總體蛋白含量降低，因此TSH含量也相應降低。而溶磷菌輔助菌絲抵抗重金屬脅迫，增強菌絲營養吸收，從而也增加了菌絲體內蛋白質含量，所以TSH含量也有所升高［43］。

4 結論

通過篩選出具抗Pb性及有溶磷能力的細菌，對Pb脅迫下生長的杏鮑菇菌絲體的生長，富集量以及一系列代謝活動作出研究，結果表明，具溶磷能力的細菌不僅可以促進菌絲體生長，還可以增強其對Pb的富集能力；在溶磷菌影響下，菌絲體氧化應激性活力增加，可以對Pb產生更強的耐受效果；溶磷菌可能會使菌絲體對營養有更好的吸收，以及促進菌絲體蛋白質含量的增加。因此推斷，具有溶磷能力的細菌在減輕Pb對杏鮑菇的毒害中有重要作用。

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（責任編輯 馬鑫）

Effect of Phosphate-solubilizing Bacteria on Oxidative Response of Pleurotus eryngii Under Lead Stress

HE Nan1，2XU Heng2
（1. ChengDu University of TCM，School of Medical Technology，Chengdu 611137；2. Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment（Ministry of Education），College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064）

In this study Pleurotus eryngii was selected to enrich Pb2+，and 8 strains with capability against Pb2+of 800 mg/L were screened from the strain library of our laboratory. Two strains CG8 and FFT1 with high phosphate-solubilizing capacity，as well as FFC6 and FFC11with low phosphate-solubilizing capacity were selected. Using 16S rDNA analysis，CG8 was identified as Klebsiella sp.，FFT1 as Pseudomonas sp.，FFC6 and FFC11 as Bacillus sp.；the similarity of their sequences reached 99%. Further，the effects of 4 strains of phosphate-solubilizing bacterium（PSB）on the mycelium growth，Pb accumulation，lipid peroxidation，the content of sulfhydryl-containing protein，and antioxidant enzyme of P. eryngii in Pb-contaminating liquid medium were investigated. The result showed that inoculation with PSB enhanced the hyphal biomass of P. eryngii and accumulation of heavy metals. Moreover，the content of MAD，and the activities of SOD and POD in mycelium decreased significantly，while the content of total sulfhydryl（TSH）increased. All results confirmed that PSB efficiently reduced the toxicity of heavy metals to P. eryngii mycelium and the oxidative stress induced by heavy metals. CG8 with the strongest capacity of solubilizing phosphate had more significant effects to resist the mycelium accumulating heavy metals and oxidative stress induced by heavy metals in P. eryngii，the accumulation of Pb increasing 96.1% and the PB-SH increasing 91.3%.

mushroom；heavy metal；phosphate-solubilizing capacity；antioxidant system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.025

2015-08-13

國家自然科學基金項目（41171253），成都中醫藥大學?；痦椖浚?30021061）

何難，女，碩士研究生，研究方向：微生物生物技術；E-mail：keke_nan@sina.com

徐恒，男，博士，研究方向：微生物生物技術；E-mail：zxwf787@163.com