MDA?7／IL?24基因聯合阿霉素對肝癌模型裸鼠金屬基質蛋白酶及血管內皮生長因子的影響

錢鶴平，林家曉

1.海門市人民醫院ICU，江蘇海門226100；2.東南大學附屬中大醫院胃肝病科

MDA?7／IL?24基因聯合阿霉素對肝癌模型裸鼠金屬基質蛋白酶及血管內皮生長因子的影響

錢鶴平，林家曉

1.海門市人民醫院ICU，江蘇海門226100；2.東南大學附屬中大醫院胃肝病科

目的 探討MDA?7／IL?24基因聯合阿霉素對肝癌模型裸鼠金屬基質蛋白酶及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影響。方法 建立肝癌移植瘤模型裸鼠后分為模型組（A組）、阿霉素組（B組）、MDA?7／IL?24組（C組）、聯合干預組（D組），并給予不同條件干預。干預后2周、6周時，測定腫瘤體積和重量、基質金屬蛋白酶（MMP）、VEGF表達量。結果 干預2周、6周時，B、C、D組小鼠腫瘤體積和重量均明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤的體積和重量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B、C、D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B、C、D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05）。結論 MDA?7／IL?24基因聯合阿霉素能夠有效地抑制肝癌模型裸鼠的腫瘤生長，減少MMP和VEGF的表達量。

肝癌；黑色素瘤分化相關抗原7；白細胞介素?24；基質金屬蛋白酶；血管內皮生長因子

肝癌是消化系統惡性程度較高的一類惡性腫瘤，腫瘤組織血供豐富、癌細胞增殖活力極強，患者的生存率較低且轉移率、復發率較高，整體預后較差［1］。阿霉素是肝癌常用的化療藥物，對癌細胞具有一定殺傷效應，但不能徹底殺死癌細胞，治療后復發率較高。黑素瘤分化相關基因?7（melanomadifferentiation associated gene?7，MDA?7）是從黑素瘤細胞中提取具有抑癌作用的基因，根據生物學特性與染色體定位命名IL?24。研究［2］表明，MDA?7／IL?24基因具有選擇性誘導腫瘤細胞凋亡的作用，且對正常細胞無任何效應。本文通過動物實驗，探討MDA?7／IL?24基因聯合阿霉素對肝癌模型裸鼠金屬基質蛋白酶及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物為BALB／c小鼠64只，購于東南大學實驗動物中心（許可證號20151015），4～6周齡，雄性，體質量20～24 g，平均（22.02±1.12）g，本次研究報請東南大學附屬中大醫院臨床研究倫理委員會批準；重組腺病毒MDA?7／IL?24由吉凱公司合成；阿霉素注射液：山西普德藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H14023143，規格10 mg；肝癌細胞中HepG2購于中國科學院上海細胞庫；細胞培養用培養基、新生小牛血清、胰蛋白酶均購于Gibco公司；酶聯免疫吸附試劑盒購于上海西唐生物公司，RNA抽提及檢測試劑盒購于北京康為世紀公司。

1.2 肝癌移植瘤模型建立方法 取HepG2細胞株，培養在含有10%新生小牛血清的培養基中，每2天換液1次，待細胞貼壁長滿后用胰酶消化傳代，傳代后取胰酶消化后的細胞，用PBS重懸并調節密度至2×106／ml，將0.2 ml細胞懸液注射于小鼠背部皮下。待腫瘤生長，挑選瘤體直徑4～5 mm的移植瘤模型鼠用于藥物干預。

1.3 動物分組及藥物干預 移植瘤模型建立成功后，將模型鼠分為模型組（A組）、阿霉素組（B組）、MDA? 7／IL?24組（C組）、聯合干預組（D組）。A組小鼠給予相同劑量的生理鹽水瘤內注射；B組小鼠給予1.00 mg／kg的阿霉素腹腔注射；C組小鼠給予重組腺病毒MDA?7／IL?24瘤內單點注射，劑量為2×106PFU／μl；D組小鼠給予1.00 mg／kg的阿霉素及2×106PFU／μl的重組腺病毒MDA?7／IL?24瘤內單點注射。

1.4 腫瘤組織的重量和體積 干預后2周、6周時，每組小鼠各取8只，頸椎脫臼法處死，解剖得到腫瘤組織后用電子天平稱瘤體重量，后用游標卡尺測量小鼠移植瘤的長徑a和短徑b，按照下列公式計算腫瘤體積：V＝0.5×a×b2。

1.5 MMP和VEGF的表達量 干預后2周、6周時，腫瘤組織用于重量和體積測量后，用生理鹽水清洗3～5遍，采用RNA抽提試劑盒提取組織中的RNA，采用反轉錄試劑盒合成RNA對應的cDNA第一鏈，而后用PCR擴增試劑盒擴增目的基因MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR2及內參基因β?actin。根據擴增曲線后計算MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR2 mRNA含量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料用x ±s表示，多組間計量資料的分析采用方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤體積和重量 干預后6周時，各組小鼠的腫瘤體積和重量均明顯高于干預后2周時（P＜0.05）；干預2周時、6周時，B、C、D組小鼠腫瘤體積和重量均明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤的體積和重量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B組和C組小鼠腫瘤的體積和重量比較差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

表1 四組小鼠的腫瘤體積和重量比較（x ±s）Tab 1 Comparison of tumor volume and weight in 4 groups of mice（x ±s）

2.2 腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA的表達量干預后2周、6周時，A組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與干預后2周比較，6周時B、C、D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量均明顯降低（P＜0.05）；B、C、 D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B組和C組小鼠腫瘤腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 四組小鼠中腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA表達量的比較（x ±s）Tab 2 Comparison of expressions of MMP3 and MMP9 mRNA in tumor tissues of 4 groups of mice（x ±s）

2.3 腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA的表達量 干預后2周、6周時，A組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2的mRNA含量比較無統計學意義（P＞0.05），與干預后2周比較6周時B、C、D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量明顯降低（P＜0.05），B、C、D組小鼠腫瘤腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B組和C組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表3）。

表3 四組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA表達量的比較（x ±s）Tab 3 Comparison of expressions of VEGF?C and VEGFR2 mRNA in tumor tissues of 4 groups of mice（x ±s）

3 討論

肝癌目前仍缺乏有效的靶向治療藥物，患者的臨床預后較差。阿霉素是臨床上常用的化療藥物，被用于多種惡性腫瘤的治療，對增殖期的癌細胞具有殺傷作用，對腫瘤的發展具有抑制和緩解作用［3］。但是單獨應用阿霉素治療肝癌并不能徹底清除癌細胞，需要聯合使用不同的藥物以更有效地抑制肝癌病情發展［4］。MDA?7基因是近年來新發現的一類抑癌基因，所表達的產物IL?24屬于IL?10家族［5］。已有多項研究證實，IL?24對多種癌細胞的增殖、侵襲、轉移均具有抑制作用，同時也能誘導癌細胞的凋亡［6?7］。國內張翔等［8］研究顯示，腺病毒過表達MDA?7能夠抑制肝癌細胞的增殖。

相關研究表明，MDA?7／IL?24基因在黑色素瘤細胞中呈明顯低表達，將其轉入惡性黑色素瘤細胞中，具有阻滯生長、促進凋亡、促進分化的作用，而與細胞中P53、P16、P21、RB、Ras、Bax等狀態無關，說明MDA?7／IL?24基因具備惡性腫瘤選擇性，且對正常細胞無毒性作用［9］。我們構建了MDA?7／IL?24基因的腺病毒載體，通過腺病毒瘤內注射的方式來增加肝癌移植瘤組織中MDA?7／IL?24的表達，聯合阿霉素腹腔注射后對腫瘤的生長情況進行了比較，結果表明，干預組小鼠腫瘤的體積和重量均明顯小于模型組，D組小鼠腫瘤的體積和重量顯著低于B組和C組。國內外學者也有類似的文獻報道［10?11］，提示MDA?7／IL?24基因的腺病毒及阿霉素均能抑制肝癌的生長，腺病毒和阿霉素具有協同作用、聯合使用能更有效地抑制肝癌的生長。

肝癌組織的生長依賴于新生血管所提供的養分及細胞向周圍的浸潤和侵襲［12］。VEGF是一類特異性的血管內皮細胞生長因子，具有不同亞型，通過與相應受體結合來促進腫瘤血管的形成。VEGFC是新生血管的主要誘導物，主要通過與VEGFR2結合來促進內皮細胞增殖、誘導腫瘤組織中新生血管的生成［13］。MMP家族分子是促進癌細胞浸潤性生長的重要分子。由癌細胞合成和分泌的MMP3和MMP9能夠降解細胞外基質中的Ⅴ、Ⅵ型膠原及層黏連蛋白等多種成分，進而促進癌細胞突破細胞外基質的限制并向鄰近組織浸潤性生長［14］。本研究中，干預組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR1 mRNA含量顯著低于模型組，聯合組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR1 mRNA含量明顯低于阿霉素組、MDA?7／IL?24組。說明MDA?7／IL?24基因的腺病毒及阿霉素均能抑制肝癌組織中VEGF和MMP的表達，腺病毒和阿霉素具有協同作用，聯合使用能有效地抑制VEGF和MMP的表達。

本研究表明，MDA?7／IL?24基因聯合阿霉素能夠有效地抑制肝癌模型裸鼠的腫瘤生長，減少MMP和VEGF的表達量，這或許可以為肝癌治療提供一種新的途徑，其應用價值仍有待于更多基礎研究與臨床研究求證。

［1］林永添，肖景榕，江惠娟，等.2011年福建省腫瘤登記地區肝癌發病率與死亡率分析［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2015，24（9）：1063?1065.Lin YT，Xiao JR，Jiang HJ，et al.Incidence and mortality of liver cancer in areas with cancer registration of Fujian province in 2011［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2015，24（9）：1063?1065.

［2］Azab B，Dash R，Das SK，et al.Enhanced delivery of mda?7／IL?24 u?sing a serotype chimeric adenovirus（Ad.5／3）in combination with the Apogossypol derivative BI?97C1（Sabutoclax）improves therapeutic ef?ficacy in low CAR colorectal cancer cells［J］.J Cell Physiol，2012，227（5）：2145?2153.

［3］袁鵬，岳天華，肖艷華，等.阿霉素對不同轉移能力肝癌細胞及肝癌干細胞相關基因表達的影響［J］.腫瘤防治研究，2015，42（12）：1192?1196.Yuan P，Yue TH，Xiao YH，et al.Influence of Adriamycin on human hepatocellular carcinoma cells with different metastatic abilities and ex?pression of cancer stem cell related genes［J］.Cancer Research on Pre?vention and Treatment，2015，42（12）：1192?1196.

［4］張波，李曉敏，李巧芳，等.三維適形放療聯合肝動脈化療栓塞術治療中晚期肝癌的臨床研究［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2014，23（7）：816?818.Zhang B，Li XM，Li QF，et al.Clinical effect of Three?dimensional conformal radiotherapy combined with TACE for the middle and ad?vanced?stage hepatic cancer［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2014，23（7）：816?818.

［5］Hamed HA，Yacoub A，Park MA，et al.Histone deacetylase inhibitors interact with melanoma differentiation associated?7／interleukin?24 to kill primary human glioblastoma cells［J］.Mol Pharmacol，2013，84（2）：171?1781.

［6］張小峰，殷正豐，艾莉，等.Mda?7／IL?24對裸鼠肝癌移植瘤的生長抑制和促凋亡作用［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16（1）：45?49.Zhang XF，Yin ZF，Ai L，et al.Mda?7／IL?24 inhibits proliferation and promotes apoptosis of transplanted hepatocellular cancer cells in nude mice［J］.Chin J Cancer Biother，2009，16（1）：45?49.

［7］Tian H，Zhang D，Gao Z，et al.MDA?7／IL?24 inhibits Nrf2?mediated antioxidant response through activation of p38 pathway and inhibition of ERK pathway involved in cancer cell apoptosis［J］.Cancer Gene Ther，2014，21（10）：416?426.

［8］張翔，孟艷玲，王磊，等.MDA?7／IL?24真核表達載體的構建和重組腺病毒的制備及其對肝癌細胞生長抑制作用的研究［J］.細胞與分子免疫學雜志，2011，27（12）：1277?1279.Zhang X，Meng YL，Wang L，et al.Construction and expression of re?combinant adenovirus adenovirus encoding MDA?7／IL?24 and its inhibi?tory effect on preparation in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2011，27（12）：1277?1279.

［9］Ma G，Kawamura K，Shan Y，et al.Combination of adenoviruses ex?pressingmelanomadifferentiation?associatedgene?7and chemotherapeutic agents produces enhanced cytotoxicity on esophageal carcinoma［J］.Cancer Gene Ther，2014，21（1）：31?37.

［10］肖朝文，王從俊，張輝，等.攜帶人黑色素瘤分化相關基因?7／白細胞介素?24基因的溶瘤腺病毒SG600?IL?24和干擾素聯合治療裸鼠肝癌［J］.中華實驗外科雜志，2013，30（1）：55?57.Xiao ZW，Wang CJ，Zhang H，et al.Treatment of hepatoma in nude mice by oncolytic adenovirus?mediated melanoma differentiation asso?ciated gene?7／interleukin?24 combined with interferon［J］.Chin J Exp Surg，2013，30（1）：55?57.

［11］Menezes ME，Shen XN，Das SK，et al.MDA?7／IL?24 functions as a tumor suppressor gene in vivo in transgenic mouse models of breast cancer［J］.Oncotarget，2015，6（35）：36928?36942.

［12］黃文，曾茹雪，鐘輝，等.康艾注射液聯合介入化療栓塞對晚期肝癌患者凝血功能及血清VEGF的影響［J］.海南醫學院學報，2014，20（10）：1380?1382.Huang W，Zeng RX，Zhong H，et al.Effects of Kangai injection com?bined with chemotherapy and embolization on advanced hepatocellular carcinoma and its effect on blood coagulation function and serum VEGF［J］.Journal of Hainan Medical University，2014，20（10）：1380?1382.

［13］陳杰，侯恩存.VEGF及其受體與肝細胞癌血管生成和抗血管治療研究進展［J］.現代腫瘤醫學，2016，24（3）：498?502.Chen J，Hou EC.Progress of VEGF and its receptors in HCC angio?genesis and anti angiogenesis therapy［J］.Modern Oncology，2016，24（3）：498?502.

［14］李傳斌，胡力.腹腔鏡與開腹肝癌切除術對血清和肝癌組織中惡性生物學指標的影響［J］.海南醫學院學報，2015，21（6）：825?828.Li CB，Hu L.Influence of laparoscopic and laparotomy hepatectomy on malignant biological indicator in serum and liver tissue［J］.Journal of Hainan Medical University，2015，21（6）：825?828.

（責任編輯：馬 軍）

EffectofMDA?7／IL?24genecombinedwithAdriamycinonmatrix metalloproteinase and vascular endothelial growth factor of hepatocarcinoma model nude mice

QIAN Heping，LIN Jiaxiao
1.Department of ICU，Haimen People’s Hospital，Haimen 226100；2.Department of Stomach and Liver Disease，Zhongda Hospital of Southeast University，China

Objective To investigate the effect of MDA?7／IL?24 gene combined with adriamycin on matrix metallo?proteinase and vascular endothelial growth factor（VEGF）of hepatocarcinoma model nude mice.Methods The model nude mice with transplanted hepatocellular carcinoma were constructed and divided into model group（group A），Adria?mycin group（group B），MDA?7／IL?24 group（group C）and combined intervention group（group D）.The groups were given different interventions.At 2 weeks and 6 weeks after the interventions，the gross tumor volume，weight，the ex?pression quantities of matrix metalloproteinases（MMP）and VEGF were measured.Results At 2 weeks and 6 weeks af?ter the interventions，the gross tumor volume and weight of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），the gross tumor volume and weight of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05），the mRNA levels of MMP3 and MMP9 in tumor tissues of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），the mRNA levels of MMP3 and MMP9 in tumor tissues of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05），the mRNA levels of VEGF?C and VEGFR2 in tumor tissues of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），and the mRNA levels of VEGF?C and VEGFR2 in tumor tissues of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05）.Conclusion MDA?7／IL?24 gene in combination with Adriamycin can effectively inhibit the tumor growth and reduce the expression quantities of MMP and VEGF in hepatocarcinoma model nude mice.

Hepatocarcinoma；Melanoma differentiated antigen?7；Interleukin?24；Matrix metalloproteinase；Vascu?lar endothelial growth factor

R735.7

A

1006－5709（2016）12－1471－04

2016?01?11

10.3969／j.issn.1006?5709.2016.12.049

江蘇省衛生科研項目（P200911）

錢鶴平，研究方向：重癥醫學。E?mail：54241107＠qq.com