炎調方抑制LPS誘導人肺泡上皮細胞炎癥因子釋放機制研究*

施榮　王倩　韓丹　熊旭東（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上?！?01203）

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炎調方抑制LPS誘導人肺泡上皮細胞炎癥因子釋放機制研究*

施榮王倩△韓丹熊旭東
（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海201203）

【摘要】目的體外觀察炎調方通過NF-κB信號通路調控內毒素（LPS）誘導的人肺泡上皮（A549）細胞中炎癥因子的釋放。方法采用炎調方藥物血清方法，觀察其對A549細胞的作用效果及其機制。MTT法觀察細胞存活率；雙抗體夾心酶聯合免疫吸附法（ELISA法）檢測細胞中白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的表達；Western blot法檢測環加氧酶2（COX2）和NF-κB的表達；運用NF-κB特異性抑制劑與炎調方聯合運用，觀察NF-κB信號通路對COX2的調控作用。結果LPS明顯抑制了A549細胞增殖，炎調方藥物血清（炎調方藥物血清）能緩解LPS的細胞毒性；炎調方藥物血清明顯降低了LPS誘導的IL-8、PGE2和COX2釋放和表達。炎調方藥物血清通過NF-κB信號通路調控COX2表達。結論炎調方通過NF-κB信號通路調控LPS的細胞毒性和炎癥因子釋放。

【關鍵詞】炎調方人肺泡上皮炎癥因子NF-κB信號通路

膿毒癥（Sepsis）是具有感染依據的全身炎癥反應綜合征。嚴重膿毒癥導致的多器官功能障礙是重癥醫學面臨的重要臨床難題，病死率可高達80%［1］。膿毒癥早期便可導致急性肺損傷（ALI），肺泡上皮細胞在多種炎癥因子的作用下，可發生彌漫性損害，影響氣體交換，最終進展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。我們早期動物實驗結果顯示，炎調方能調控膿毒癥大鼠血清中炎癥因子釋放，保護肺組織［2-3］。本實驗采用內毒素（LPS）干預人肺泡上皮細胞A549，造成急性肺損傷細胞模型，觀察炎調方藥物血清對A549的保護作用，并從NF-κB信號通路探討其機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1試藥與儀器1）炎調方由桃仁、生大黃、芒硝、玄參、赤芍、當歸等組成，均符合2005版《中國藥典》規定并加工炮制合格的飲片，由上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房提供。煎煮方法：加10倍體積蒸餾水將飲片浸泡30 min，先煮桃仁、玄參、赤芍、當歸，沸騰后繼續煎煮20 min，起鍋前10 min加入大黃，第2煎加6倍體積的蒸餾水煎煮，沸騰后繼續煎煮20 min。2次煎液混合，用4層無菌紗布過濾，芒硝最后納入藥液中充分溶解，藥液最后濃縮成含生藥1.0 g/mL。2）DMEM培養基（美國GIBCO公司）；胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司）；噻唑藍（MTT，美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；LPS和PDTC（美國Sigma公司）；抗體COX2（sc-23984，goat polyclonal，1∶800）和NF-κB p65（sc-372，rabbit polyclonal，1∶200）（美國Santa Cruz公司）；抗體GAPDH（kc-5G4，mouse polyclonal，1∶10000）（中國康成公司）；抗體human toll-like receptor 4（TLR4）antibodies（14-9917-80，mouse monoclonal，25 μg）（美國eBioscience公司）；白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的ELISA試劑盒（美國R&D公司）。3）CO2細胞恒溫培養箱（美國Thermo Forma公司）；Healforce生物安全柜（香港力康發展有限公司）；OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；臺式離心機（日本KUBOTA公司）；Odyssey紅外熒光掃描成像系統（美國Li-cor公司）；Syergy2酶聯免疫檢測儀（美國Biotek公司）。1.2實驗動物SD大鼠，清潔級，體質量200 g，購自中國科學院，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心。

1.3藥物血清的制備將SD大鼠隨機分為炎調方組和陰性對照組，每組8只。實驗前禁食12 h，炎調方組以9.9 g/kg水煎液劑量灌胃，陰性對照組灌等體積的0.9%氯化鈉注射液。連續給藥3 d，每日分早、晚兩次給藥，于第4日第1次灌胃1 h后（灌藥前禁食不禁水12 h）采血。無菌條件下腹總動脈采血，靜置2 h，4000 r/min，離心10 min，分離血清（藥物血清）。同種條件血清混勻，于56℃水浴30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存備用。臨用前，將各組藥物血清分別加入DMEM培養液，配制成濃度為5%、10%、20%含藥物血清培養液。

1.4細胞培養人肺泡上皮細胞A549和人巨噬細胞THP-1購于中國科學院上海細胞庫。A549和THP-1細胞種植在DMEM完全培養基（含10%FBS、0.01 mg/mL Insulin，100 U/mL、青鏈霉素混合液，20 mmol/L HEPES）中，細胞在37℃、5%CO2環境中單層生長，實驗時取對數生長期的細胞。

1.5細胞增殖檢測取1×105個/mL A549細胞接種于96孔板，培養至第2日細胞貼壁后，LPS 1、10、100 μg/mL分別干預A549細胞6、12、24 h；血清用10%、20%、30%炎調方藥物血清作為處理組劑量，相應濃度的無藥物血清作為陰性對照組，每組設4個復孔，孵育細胞12 h。將MTT用無血清DMEM培養液配成0.5 mg/mL溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），每孔加20 μL，37℃溫育4 h，小心吸出孔內上清液，加入150 μL DMSO，用全自動酶標儀在490 nm處測定各孔OD值。用下列公式計算藥物血清對細胞生長的抑制率，并繪制效應曲線，同樣的實驗重復3次。細胞生存率（%）=（OD藥物-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%

1.6Western blot實驗裂解組織提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測COX2、NF-κB及GAPDH蛋白的表達。常規SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，分別將膜稀釋好的一抗（1∶1000，5%脫脂奶粉稀釋）封入雜交袋內，4℃搖蕩過夜。然后，分別將膜稀釋好的熒光二抗（1∶10000稀釋）封入雜交袋內，避光室溫搖蕩1 h。Odyssey紅外熒光掃描成像系統讀膜。

1.7ELISA實驗嚴格按試劑盒要求操作，雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞中白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的釋放量，ELISA試劑盒為R&D公司原裝產品，由上海森雄科技實業有限公司提供。

2　結果

2.1LPS對肺泡上皮細胞A549存活率的影響見表1。為了觀察LPS對A549細胞的毒性，分別應用LPS1、10和100 μg/mL處理細胞6、12和24 h。MTT法觀察細胞存活率，實驗結果顯示LPS質量為10 μg/mL 和100 μg/mL呈時間-劑量依賴性抑制了A549細胞增殖，與未處理組差異有統計學意義（P＜0.05）。其中10 μg/mL LPS干預A549細胞6、12和24 h，其細胞存活率分別為80%、61%與22%。LPS 10 μg/mL干預A549細胞12 h用于進行后續實驗。

表1　不同濃度LPS在不同時間點對A549細胞存活率的影響（±s）

表1　不同濃度LPS在不同時間點對A549細胞存活率的影響（±s）

與對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　24 h LPS 100 μg/mL組　9.88±2.67△未處理細胞對照組LPS 1 μg/mL組　92.74±4.69△LPS 10μg/mL組　22.29±3.99△6 h　12 h 67.23±4.26 30.18±1.57△100±3.18 99.97±2.75 96.12±4.01△80.13±7.01 60.85±2.61△

2.2炎調方藥物血清對肺泡上皮細胞A549存活率的影響見表2。MTT法檢測不同濃度炎調方藥物血清干預A549細胞12 h的存活率，同時以正常大鼠血清作對照。實驗結果顯示，炎調方藥物血清10%、20%與30%均未表現任何細胞毒性。因此炎調方藥物血清10%、20%與30%用于改善LPS 10 μg/mL致細胞增殖抑制實驗。與單獨運用LPS 10 μg/mL相比，炎調方藥物血清10%、20%與30%分別將細胞存活率提高了20.6%、25.9%與28.9%（P＜0.05）。實驗結果表明，炎調方能改善LPS導致的A549細胞損傷。

2.3炎調方藥物血清對LPS誘導A549細胞釋放IL-8和PGE2的影響見表3。為了觀察炎調方藥物血清對LPS誘導的IL-8和PGE2釋放量的影響，將LPS分別與炎調方藥物血清10%、20%及30%聯合運用。采用ELISA方法檢測IL-8和PGE2的表達水平。單獨運用LPS 10 μg/mL明顯增加了A549細胞中IL-8和PGE2的含量。而炎調方藥物血清20%和30%分別致LPS誘導的IL-8含量降低了約31%和50%；PGE2的含量分別降低了34%和48%（P＜0.05）。其中細胞表面的LPS受體TLR4作為陽性對照。LPS誘導的IL-8和PGE2均被TLR4抑制。

表2　炎調方藥物血清對LPS致A549細胞損傷的改善作用（%，±s）

表2　炎調方藥物血清對LPS致A549細胞損傷的改善作用（%，±s）

與LPS比較，*P＜0.05。下同。

組別　n正常對照組LPS 10 μg/mL組10%炎調方藥物血清組存活率100.00±4.83 59.30±3.67 95.24±1.39 20%炎調方藥物血清組　94.21±3.88 30%炎調方藥物血清組　97.40±1.28 LPS+10%炎調方藥物血清組　79.93±4.24*LPS+20%炎調方藥物血清組　85.22±2.23*LPS+30%炎調方藥物血清組　88.25±3.41*

表3　炎調方藥物血清對LPS誘導IL-8和PGE2釋放的緩解作用（pg/mL，±s）

表3　炎調方藥物血清對LPS誘導IL-8和PGE2釋放的緩解作用（pg/mL，±s）

組別　n正常對照組LPS 10 μg/mL組10%炎調方藥物血清組20%炎調方藥物血清組30%炎調方藥物血清組LPS+Anti-TLR4組IL-8　PGE226.67±5.01　23.50±3.39 712.50±56.90　60.83±5.34 650.17±53.86　54.83±4.26 494.67±31.15*　40.17±3.31*355.33±49.96*　31.50±4.51*301±35.97*　28.17±4.62*

2.4炎調方藥物血清對LPS誘導A549細胞中COX2表達量的影響為了觀察炎調方藥物血清對LPS誘導COX2表達量的影響，將LPS分別與炎調方藥物血清10%、20%及30%聯合運用。采用Western blot方法檢測COX2的表達水平。實驗結果如圖1所示，與未處理的細胞對照組比較，LPS顯著誘導了COX2高表達。而當LPS分別與炎調方藥物血清10%、20%及30%聯合運用時，COX2的高表達量呈劑量依賴性被抑制。為了觀察炎調方藥物血清對COX2的作用是否特異性地針對A549細胞，筆者運用LPS干預人巨噬細胞THP-1，發現炎調方藥物血清同樣降低了LPS誘導的COX2高表達，但其作用不及A549細胞中明顯。

圖1　炎調方藥物血清對LPS誘導COX2高表達的抑制作用

2.5炎調方藥物血清通過NF-κB信號通路抑制COX2表達實驗結果如圖2A所示，LPS誘導了A549細胞中NF-κB（p65）的表達，炎調方藥物血清20%和30%明顯抑制了LPS誘導的NF-κB（p65）的高表達。而在THP-1細胞中炎調方藥物血清調控NF-κB（p65）的作用不明顯。為了進一步證實炎調方藥物血清對COX2的抑制作用主要通過NF-κB信號通路，筆者運用了NF-κB特異性抑制劑PDTC。結果顯示，PDTC逆轉了炎調方藥物血清對高表達量COX2的抑制作用（圖2B）。因此筆者推斷，炎調方藥物血清通過NF-κB信號通路抑制COX2表達。

圖2　炎調方藥物血清通過NF-κB信號通路調控COX2表達

3　討論

嚴重膿毒癥可誘發多臟器功能障礙綜合征（MODS）。肺是最易受損的器官，其發生率約為40%［4］，病死率約為30%～50%［5］。失控的炎癥反應或毒素可激活多種炎性細胞在肺組織聚集、活化，造成肺泡上皮細胞彌漫性損傷，肺泡表面活性物質減少，以肺容積減少、順應性降低、嚴重的通氣/血流比例失調為病理特征，臨床表現為進行性低氧血癥。

肺泡上皮細胞可分為Ⅰ型和Ⅱ型，是覆蓋于肺泡表面的一層上皮細胞。肺泡上皮細胞通過合成和分泌表面活性物質，維持肺泡的穩定性、保持肺泡表面水電解質平衡等，起到維持肺組織正常的氣體交換功能。感染導致LPS的大量和持續釋放是導致ALI發生、發展的主要因素之一。LPS可直接刺激肺泡上皮，產生多種氣道趨化性細胞因子。IL-8是多形核細胞和T淋巴細胞激活趨化因子。IL-8的釋放可趨化中性粒細胞（PMN）在肺聚集，促進PMN的趨化、變形、脫顆粒、釋放溶酶體酶等參與炎癥反應；巨噬細胞炎癥蛋白-2 （MIP-2）在PMN向肺泡內募集機制中起重要作用，其

最主要的趨化性細胞因子也是IL-8［6］。LPS導致的ALI過程中，IL-8濃度呈持續升高，肺泡灌洗液中IL-8含量在PMN聚集之前即增高。COX2是花生四烯酸合成前列腺素的重要限速酶，花生四烯酸及其代謝產物在急性肺損傷中作用復雜［8］。COX-2主要分布在肺巨噬細胞和肥大細胞，生理狀態下，肺組織內COX-2僅有少量表達，ALI肺組織COX-2表達明顯增高，COX-2濃度與肺損傷程度呈明顯正相關。PGE2是一種常見的前列腺素，具有廣泛的生理和病理功能，是炎癥、疼痛、發熱反應中的重要介質［7］。多種細胞因子可誘導COX-2表達及PGE2合成，參與肺損傷。NF-κB通過參與多種細胞因子基因的轉錄，而對這一調控網絡產生復雜的影響。激活的NF-κB可增強細胞因子的轉錄，使炎癥細胞合成炎癥因子的時間和數量得以增高［9］。因此，NF-κB是核內炎性遞質基因轉錄的開關。本研究結果顯示，LPS可誘導肺泡上皮細胞A549中IL-8、PGE2和COX2的釋放，炎調方藥物血清可降低LPS誘導的IL-8 和PGE2釋放量以及COX2的表達，緩解炎癥趨化因子和炎癥介質的釋放可能是炎調方藥物血清抗炎的作用機制之一。炎調方藥物血清可抑制LPS誘導A549細胞的NF-κB活性，炎調方藥物血清可能通過此途徑減少炎癥介質的產生，減輕炎癥介質對肺的損傷。

膿毒癥在中醫學理論體系中并無相應的病名，屬于中醫學“溫熱病”范疇［10］。膿毒癥早期主要以身灼熱、煩渴、腹脹便秘為主癥，甚或出現斑疹隱隱、神昏譫語，舌絳少津，苔黃，脈數等癥。自擬炎調方由桃仁、生大黃、芒硝、玄參、赤芍、當歸等組成，具有通腑活血、涼營解毒之功。全方切中膿毒癥腑實、營熱、血瘀之根本病機。前期臨床研究證實，炎調方通腑活血、涼營解毒，對膿毒癥有良好療效［11］。動物實驗中，炎調方能通過NF-κB通路，調控膿毒癥大鼠血清中炎癥因子IL-6和IL-10的釋放［2-3］，保護肺組織。本研究采用體外藥物血清方法，進一步研究炎調方的作用機制，為其藥理研究提供一定的實驗依據。

參考文獻

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·研究報告·

·研究報告·

Mechanism of Yantiaofang inhibiting LPS induced inflammatory cytokines release in human alveolar epithelial cells

SHI Rong，WANG Qian，HAN Dan，et al.Shuguang Hospital Affiliated with University of T.C.M，Shanghai 201203，China

【Abstract】Objective：To observe the release of inflammatory cytokines in the LPS induced human alveolar epithelial（A549）cells through NF-κB signaling pathway in vitro.Methods：The effect and mechanism of A549 cells were observed by the method of drug serum with Yantiaofang.Cell survivals were observed by MTT assay.The levels of IL-8 and PGE2 were detected by ELISA assay.The expressions of COX2 and NF-κB were detected by Western blot analysis.The regulatory effect of NF-κB signaling pathway on COX2 was observed by using the combination of the specific inhibitor of NF-κB and Yantiaofang.Results：LPS significantly inhibited the proliferation of A549 cells.Moreover，the cytotoxicity of LPS can alleviate by the drug serum with Yantiaofang（YTF）.YTF significantly reduced the release of IL-8，PGE2and COX2 release induced by LPS.The expression of COX2 was regulated by YTF through NF-κB signaling pathway.Conclusion：Yantiaofang regulates LPS induced cytotoxicity and inflammatory cytokine release by NF-κB signaling pathway.

【Key words】Yangtiaofang；Alveolar epithelial cell；Inflammatory factors

中圖分類號：R631

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0572-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.003

*基金項目：上海市科學技術委員會科研計劃項目（15ZR1442000）

通信作者△（電子郵箱：doctorshi@126.com）

收稿日期（2015-11-20）