黃芪保心湯對擴張型心肌病大鼠心室重構的影響*

鄭義　張培影　孫蓉蓉　李志剛　李先池（.南京中醫藥大學，江蘇　南京　003；.江蘇省徐州市中心醫院，江蘇　徐州　009）

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黃芪保心湯對擴張型心肌病大鼠心室重構的影響*

鄭義1張培影2△孫蓉蓉1李志剛2李先池2
（1.南京中醫藥大學，江蘇南京210023；2.江蘇省徐州市中心醫院，江蘇徐州221009）

【摘要】目的觀察黃芪保心湯對鹽酸阿霉素致擴張型心肌?。―CM）大鼠心功能及心室重構的影響。方法55只大鼠分為正常組6只和造模組49只，造模組使用阿霉素腹腔注射8周后，36只DCM成模大鼠分為：中藥組給予黃芪保心湯5 mL/kg灌胃，西藥組予卡托普利50 mg/kg，聯合組予卡托普利和黃芪保心湯聯合給藥，造模組作為模型組不予處理，對照組和造模組正常喂飼。4周后再次行心臟彩超觀測心室重構的變化，酶聯免疫法（ELISA）檢測血清腦鈉素（BNP）、基質裂解素2（ST2）的含量，測定左室質量分數（LVMI），蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌形態，天狼猩紅苦味酸（SR）染色測定心肌膠原容積分數（CVF）。結果與造模組比較，中藥組、西藥組、聯合組左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左心室射血分數（EF）、左心室短軸縮短率（FS）均有顯著差異（P＜0.05），BNP、ST2水平均有降低（P＜0.01），LVMI及CVF有顯著降低（P＜0.01）。結論黃芪保心湯可以改善擴張型心肌病大鼠心功能及延緩心室重構進程，聯合西藥效果更加顯著。

【關鍵詞】黃芪保心湯擴張型心肌病心室重構中醫藥

擴張型心肌?。―CM）是一種以左右心室或雙心腔擴大和收縮功能障礙為主要特征，臨床上以左室收縮功能降低、進行性心力衰竭、室性和室上性心律失常等為主要表現的心肌?。?］。中醫根據臨床癥狀的不同，把擴張型心肌病歸于“心悸”“怔忡”“水腫”“胸痹”“痰飲”等范疇。DCM末期，因細胞外基質增生及炎癥因子等影響，心肌中纖維型膠原成份異常增生堆積，這種心肌間質膠原網絡的重構形成了心肌纖維化［2］。

近些年以黃芪為君藥的中藥復方制劑在治療心肌梗死、心力衰竭、心律失常等方面發揮了很好的作用，亦有以“保心湯”命名的方劑，但組成不同，其中的藥效可能不同。如陳世宏等研究的此湯劑由黃芪、丹參、白芥子等構成，可抑制心肌壞死及凋亡，增加心肌收縮力，以治療缺血性心肌病為主［3］。本文通信作者張培影教授結合多年經驗，組成中藥復方，方由黃芪、黨參、丹參，連翹、鱉甲等構成，主治擴張型心肌病后期陰陽兩虛，痰瘀互結的證型，臨床療效甚好。筆者采用阿霉素致大鼠擴張型心肌病模型，通過對心肌纖維化血液指標、形態學的初步研究及分析，觀察黃芪保心湯改善DCM心功能及延緩心肌纖維化進展的作用?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物55只成年健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質量（200±50）g，由江蘇省徐州醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2010-0003。

1.2儀器與試藥1）儀器。心臟彩超儀（美國通用公司VIVID9），血清離心機，酶標儀，石蠟包埋機，石蠟切片機（Leica RM2235），光學顯微鏡（Olympus CKX41）。2）試劑。注射用多柔比星（浙江海正藥業，批號H32026448），10%水合氯醛，4%甲醛，20%蔗糖溶液，乙醇，二甲苯，中性樹膠，大鼠腦鈉素（BNP）、基質裂解素2（ST2）ELISA試劑盒（購于加拿大HCB公司）。3）中藥飲片及藥品。黃芪保心湯由黃芪30 g，黨參20 g，丹參15 g，連翹12 g，牡丹皮12 g，鱉甲9 g，桂枝6 g，麥冬12 g，五味子6 g組成，由徐州市中心醫院中藥房提供。煎制成3 g/mL濃縮液，稀釋后使用?？ㄍ衅绽ńK黃河藥業股份有限公司，批號H32026448，25 mg/片）研磨后用去離子水溶解成5 mg/mL溶液。給藥劑量按照成人及大鼠體表面積系數換算。

1.3分組與造模大鼠隨機分成對照組6只，模型組49只。模型組腹腔注射鹽酸多柔比星（2.5 mg/kg），對照組大鼠注射等量的0.9%氯化鈉注射液，每周注射1次，共8次［4-5］。最后造模成功的大鼠36只，隨機分成造模組、中藥組、西藥組、聯合組，每組9只。

1.4給藥方法1）造模組：造模成功后予0.9%氯化鈉注射液注射純凈水灌胃5mL/kg，每日1次，共4周。2）中藥組：予黃芪保心湯，按照人每日使用生藥150 g/kg計算，給予保心湯15 g/kg（此為生藥量，煎制后濃度為3 g/kg，即5 mL/kg）灌胃，每日1次，共4周。3）西藥組：給予卡托普利片50 mg/kg，配制成5 mg/kg溶液灌胃，頻次同中藥組。4）聯合組：給予黃芪保心湯方（劑量、頻次同中藥組）加卡托普利（劑量、頻次同西藥組）。原對照組6只繼續對照觀察，純凈水灌胃5mL/kg，每日1次，共4周。

1.5檢測指標及方法1）超聲檢測擴張型心肌病模型。造模完成（8周）2周后，大鼠10%水合氯醛麻醉，心前區備皮，仰臥位，采用多功能超聲診斷儀，用10 S探頭（探頭頻率11.0 MHz）檢測。取胸骨旁左室長軸切面，獲得清晰的左心室標準區二維圖像，分別測量左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左心室射血分數（EF）、左心室短軸縮短率（FS），取3個心動周期求平均值。2）纖維化血清標記物測定。彩超完成后快速剖開大鼠腹腔，分離出下腔靜脈，勻速緩慢抽血，注入促凝管中靜置20 min后以4℃、4000 r/min，離心5 min，取上清置于-80℃保存。檢測時嚴格按照BNP、ST2試劑盒步驟進行操作。3）形態學及纖維化的病理學檢測。解剖同時取大鼠心臟，分離左心室部分，4℃0.9%氯化鈉注射液中反復擠壓，擠出心臟內血液，濾紙吸干剩余水分后稱取質量，并計算左室質量指數（LVMI=左室重量（g）/大鼠體質量（kg）［6］。切取左室橫截面，置于4%甲醛中固定24 h后行病理學檢測。4）蘇木精-伊紅（HE）染色。心臟纖維化的主要病理表現是心肌間質膠原過度沉積［7］，作為主要的形態學觀測指標，能說明病變心肌的基本病理變化。操作步驟：常規脫水、石蠟包埋及切片、染色，分別在不同倍數下觀察心肌細胞排列、形態、細胞核等的變化。5）天狼猩紅-苦味酸（SR）染色：能夠分辨膠原纖維與正常心肌組織，并計算心肌膠原容積分數（CVF）。常規石蠟切片脫蠟至水，在天狼猩紅苦味酸溶液中浸泡1 h，水洗后蘇木素復染，隨后在光學顯微鏡下觀察膠原分布，取5個不重疊的視野，使用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件計算［8］，取平均數。

1.6統計學處理應用SPSS16.0統計軟件分析。計量資料以（x±s）表示。多組均數間比較用ANOVA檢驗，多組均數間兩兩比較用LSD檢驗。生存分析用Kaplan-Meier方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組一般存活情況及生存率比較造模大鼠在第6周開始死亡，第8周造模結束后共死亡4只。造模組出現不同程度活動度下降、脫毛、腹水、呼吸急促等癥狀。治療組中，中藥組、西藥組、聯合組活動度等表現明顯較造模組好；聯合組情況較中藥組、西藥組好。對照組100.00%（6/6），造模組44.44%（4/9），中藥組66.67% （6/9），西藥組77.78%（7/9），聯合組88.89%（8/9）。

2.2各組心臟超聲檢測結果比較見表1。與對照組相比，造模組LVEDD、LVESD、EF、FS均有明顯變化，提示造模成功；中藥組、西藥組、聯合組LVEDD、LVESD差異無統計學意義（P＞0.05），EF、FS則顯著降低（P＜0.05）。與造模組比較，中藥組、西藥組、聯合組LVEDD、LVESD、EF、FS差異有統計學意義（P＜0.05）。2.3各組血清BNP、ST2檢測結果比較見表2。與對照組比較，造模組、西藥組、中藥組、聯合組BNP、ST2均有升高（P＜0.01）。與造模組組比較，中藥組、西藥組、聯合組BNP及ST2均有不同程度下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；組間比較中藥組、西藥組、聯合組差異無明顯統計學意義（P＞0.05）。

表1　各組心臟超聲結果比較（±s）

表1　各組心臟超聲結果比較（±s）

與造模組比較，*P＜0.05。

組別n對照組6造模組4中藥組6 LVEDD（mm）LVESD（mm）EF（%）　FS（%）6.25±0.53　3.69±0.28　83.12±2.43 46.62±2.18 7.12±0.55　4.50±0.57　56.38±6.34 26.38±4.43 6.81±0.27*　3.75±0.25*62.25±2.37*37.00±2.87*西藥組　7　6.62±0.18*　3.62±0.18*62.38±3.92*32.12±2.53*聯合組　8　6.17±0.26*　3.70±0.25*63.88±4.29*32.50±2.14*

表2　各組大鼠血清BNP及ST2水平比較（±s）

表2　各組大鼠血清BNP及ST2水平比較（±s）

與造模組比較，*P＜0.01。

組別　n對照組　6造模組　4中藥組　6 BNP（μg/L）　ST2（ng/mL）43.04±2.65　1.63±1.03 83.13±2.10　7.42±4.77 68.05±1.53*　4.63±1.52*西藥組　7　69.43±3.57*　4.58±1.09*聯合組　8　66.63±3.87*　4.45±1.24*

2.4各組LVMI及CVF比較見表3。1）LVMI：與對照組比較，造模組、中藥組、西藥組、聯合組心室質量指數均顯著增加（P＜0.01）；與造模組比較，中藥組、西藥組、聯合組指數明顯減?。≒＜0.01）；中藥組、西藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；聯合組與中藥組有明顯差異（P＜0.05）。2）CVF：與對照組比較，造模組、中藥組、西藥組、聯合組CVF均顯著增加（P＜0.01）；與造模組比較，中藥組、西藥組CVF差異無統計學意義（P＞0.05），而聯合組CVF有明顯降低（P＜0.01）。

表3　各組大鼠LVMI及CVF比較（±s）

表3　各組大鼠LVMI及CVF比較（±s）

與造模組比較，*P＜0.01；與中藥組比較，△P＜0.05。

組別　n對照組　6造模組　4中藥組　6 LVMI（g/kg）　CVF（%）1.87±0.06　8.55±0.92 2.35±0.11　19.34±2.82 2.11±0.10*　15.48±2.62*西藥組　7　2.03±0.12*　15.27±1.00*聯合組　8　2.00±0.07*△　14.93±2.63*△

2.5各組心肌細胞HE染色比較見圖1。對照組：正常大鼠心肌細胞排列整齊密集，核均染，胞漿紋理清楚，細胞間隙正常。造模組：細胞排列紊亂、形態多樣，部分核固縮、深染，肌細胞之間間隙增寬，大量空泡變性。中藥組：心肌細胞排列尚整齊，大量心肌細胞肥大，核深染、少數心肌間質血管充血，輕度空泡變性。西藥組：心肌細胞排列稍紊亂，形態稍有不同，部分核增大、深染，輕度間質血管充血。聯合組：心肌細胞排列較對照組稍有紊亂，但優于中藥組、西藥組，心肌細胞肥大不甚明顯，輕度空泡變性，無核深染及增大，無間質血管充血。

圖1　各組心肌細胞HE染色比較（×400）

2.6各組心肌細胞SR染色比較見圖2。此種染色方法中，黃色為正常心肌組織，紅色為膠原纖維［9］。1）對照組：基本為正常心肌組織，稍有纖維化組織。2）造模組：心肌間質大量纖維化，走行在正常心肌細胞間。3）中藥組：可見較多纖維組織，較造模組稍減少。4）西藥組：仍可見部分散在膠原纖維，較中藥組減少。5）聯合組：膠原纖維明顯較中藥組、西藥組少，可見大量正常心肌細胞中少量膠原纖維，肌纖維間隙較對照組稍寬。

圖2　各組心肌細胞SR染色比較（×400）

3　討論

有實驗研究表明，心衰病程后期主要的中醫證型是氣虛血瘀［10］。DCM后期，單純使用強心、利尿等方法難以見效，應遵循“急則治其標”，即急性期用西藥治療，“緩則治其本”，即非急性期使用中藥共同治療頑固性心衰的原則［11］。著名醫家施今墨認為心衰主要病機為心陰陽兩虛，氣滯血瘀，從不同癥狀辨證論治：心脾兩虛，治宜益氣養血、補心健脾；若以水腫為主，當判斷證候虛實。水腫虛證為心陽不足，腎陽虛衰，輕則益氣強心、通陽利水，從心陽治療即可收效；重則宜溫腎壯陽、利水消腫，方用金匱腎氣丸、滋腎通關丸等，心腎同治，方有作用。水腫重癥，應用利水、活血、行氣，以氣滯血瘀、水氣泛濫為標實圖治［12］。王振濤教授認為病毒性心肌炎性心肌纖維化的關鍵可總結為“虛”“瘀”“毒”3個字。以正虛為本。氣陰兩虛。瘀血阻絡。熱毒留戀為主要病機［13］，其研制的“抗纖益心方”對擴張型心肌病大鼠的心肌纖維化及細胞凋亡具有明顯抑制作用。實驗通過對心肌組織進行免疫組化染色（MMP-1/TIMP-1、Bax/Bcl-2），tunnel法進行凋亡細胞染色，發現中藥高劑量組能夠顯著降低MMP-1、Bax的含量，同時升高TIMP-1、Bcl-2的水平（P＜0.05），表明此方能夠對心肌纖維化能夠產生一定作用［14-15］。鄧鐵濤教授認為，“心屬陽中之陽”，故心衰辨證為心陽虛為主要方面，結合痰瘀等病理因素，宜益氣暖心、通陽行瘀，則心氣得復，水氣可行［16］。

張培影教授通過多年經驗，綜合各醫家思想，認為擴張型心肌病從中醫上辨證病機為本虛標實，本虛包括氣虛、陽虛，標實有痰飲、水濕、瘀血；病位在心，與肺、脾、腎相關。DCM雖已正氣虛為本，邪毒、瘀血、水濕為標，而在疾病不同階段應根據辨證分期論治。早期辨證以心肺氣虛，瘀血、痰飲阻滯為主，癥狀表現為胸悶、氣短，或痰中帶血，勞累后心悸、喘滿不得臥；中期病邪入里，心脾兩虛，氣虛不能攝陽，更不能行血，致痰瘀互結，水飲內停腸胃而成痰飲，出現水腫、腹脹等癥狀；晚期邪氣入少陰，損腎之陽氣而致心腎陽虛，瘀血不去，水濕泛溢肌表成為溢飲，可出現畏寒肢冷、下肢浮腫，嚴重者可出現胸水、腹水。治法應標本兼治，治標當化痰祛飲，利水除濕，活血化瘀，治本以益氣滋陰，兼補陰陽。故組方名為“黃芪保心湯”，方中黃芪、黨參為君藥，《本草正義》則認為黨參可益氣、健脾、潤肺，功效不遜人參，提出“凡百證治之應用人參者，亦無不可以潞黨參投之”。丹參、鱉甲等為臣藥，意為滋陰活血，共奏益氣之功。連翹為佐藥，一則清心解毒，解心臟之毒，使心神得安，心之氣血陰陽貫通，二則作為使藥，引藥入心經。桂枝、茯苓引經溫經，通陽利水。全方以益氣活血為主，兼有解毒、滋陰、利水之功，使心衰后期氣虛血瘀、瘀毒互結之證得到緩解。

本實驗對阿霉素造成DCM大鼠進行心功能、纖維化血清學和形態學的組間比較，來評價黃芪保心湯方的藥效。心功能評價方面，心臟超聲以造模后心功能指標較正常明顯變化者為成模標準，中藥組、西藥組、聯合組在治療后較對照組心臟超聲指標EF、FS仍有較大差距，但與造模組比較，治療組各項指標明顯好轉，提示黃芪保心湯可明顯提高射血分數，增加左室短軸縮短率，改善心肌收縮力。BNP是反映心功能及心肌纖維化的較敏感指標，在2013年ACCF/AHA心衰指南中，BNP仍然是診斷心衰的重要輔助手段，其可廣泛用于判斷心衰的進展和預后?？扇苄許T2（sST2）是白介素1受體（IL-1R）家族成員，當心肌細胞、成纖維細胞受到生物機械性拉伸后會引起sST2和IL-33產生增加，參與保護心臟的應激反應信號途徑［17］，其對心衰的預后有重要意義。

LVMI可以反映心肌細胞肥大，CVF則能夠反映心肌纖維化程度［18］。實驗中西藥組、聯合組LVMI不僅較造模組有明顯差異，且聯合用藥組較西藥組亦有顯著差異，提示中西醫聯合治療可能在抑制心肌細胞肥大方面優于單純西藥治療。對CVF的測定則從心肌細胞的形態學直觀表現出中西醫聯合治療可以減少心肌纖維化，逆轉心室重構，改善心功能。

中藥復方治療心梗后心衰、心肌病致慢性心衰的研究眾多，如真武湯治療肥厚型心肌?。?9］，生脈散通過抑制心肌膠原的過度降解減緩心室重構進程［20］，特別是芪藶強心膠囊被首次寫入中國心衰治療指南，更是對中醫藥療效的肯定。本實驗初步評價黃芪保心湯及其聯合西藥在改善大鼠心功能和心肌纖維化方面的影響，但由于存在樣本量較小，不能全面概括生存率、死亡率及預后等問題，仍需要大規模的臨床及基礎實驗研究。至于黃芪保心湯是否通過抑制RAAS系統激活、改善內皮功能，阻止細胞凋亡及氧化應激和基因調控等途徑改善心肌纖維化仍需要進一步研究。

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Influence of Huangqi Baoxin（HQBX）Decoction on Ventricular Remodeling in Rats with Dilated Cardiomyopathy（DCM）

ZHENG Yi，ZHANG Peiying，SUN Rongrong，et al.Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China.

【Abstract】Objective：To observe the influence of Huangqi Baoxin（HQBX）decoction on heart functions and cardiac fibrosis in rats with dilated cardiomyopathy（DCM）.Methods：Fifty-five rats were divided into the normal group（6）and DCM model group（49）in which rats were given intraperitoneal injection of doxorubicin for eight weeks.Echocardiography was made to choose the DCM rats which were then randomly divided into group B，C，D and E.Group C were given HQBX decoction 5 mL/（kg·d）；group D received captopril 50 mg/（kg·d）；group E adopted a combination of HQBX decoction and captopril with the same volume mentioned.Echocardiography was made again to explore heart functions including LVEDD，LVESD，EF and FS.Left ventricular mass index（LVMI）was also explored.ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）was used to assess the levels of BNP，ST2，then HE staining to detect myocardium shape，and SR staining to differenciate collegen volume fraction（CVF）.Results：Compared with group B，LVEDD，LVESD，EF and FS changed remarkably（P＜0.05）；BNP and ST2 greatly reduced（P＜0.01）；LVMI and CVF both notably decreased（P＜0.01）.Conclusions：HQBX decoction can improve heart function and ventricular remodeling in rats with dilated cardiomyopathy，and make a better effect plus western medicine.

【Key words】Huangqi Baoxin decoction；Dilated cardiomyopathy；Ventricular remodeling；TCM

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0583-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.006

*基金項目：江蘇省徐州市科技局社會發展項目（KC14SX09）

通信作者△（電子郵箱：Zhang_peiy@163.com）

收稿日期（2015-12-04）