snoRNA表達譜與胃癌預后的關聯研究

韓璐，宋豐舉，黃育北，鄭紅，陳可欣

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snoRNA表達譜與胃癌預后的關聯研究

韓璐，宋豐舉，黃育北，鄭紅，陳可欣

目的分析胃癌組織中snoRNA表達與胃癌預后的關聯。方法胃癌患者90例，搜集其臨床資料并隨訪。應用基因芯片技術，檢測患者癌組織中405種snoRNA的表達水平，以每個snoRNA表達的中位數為界將胃癌患者分為高表達組和低表達組，進行單因素和多因素生存分析，比較2組患者總生存和無進展生存的差異。對存在差異的snoRNA按保護因素=0、危險因素=1擬合出危險評分。以年齡、性別、是否吸煙、是否飲酒、組織學分化（中高分化與低分化）、腫瘤大?。ǎ? cm組和 5 cm組）、腫瘤位置（上1/3與中下2/3）、臨床分期（Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ期組）和snoRNA危險評分（低、中和高危組）為自變量，總生存和無進展生存為因變量，進行多因素Cox回歸分析胃癌患者總生存和無進展生存的影響因素。結果19個snoRNA的高、低表達者間總生存和（或）無進展生存時間差異有統計學意義（P＜0.05）。Cox回歸分析模型示，ACA61、ACA27和U36A高表達患者的總生存以及無進展生存較好，而ENSG00000206898高表達患者的總生存及無進展生存較差（P＜0.01）。snoRNA危險評分是胃癌患者總生存和無進展生存的獨立影響因素；相較于低危組，中、高危組的總生存和無進展生存時間短（P＜0.001）。結論ACA61、ACA27、U36A和ENSG00000206898的表達很可能是胃癌預后的獨立預測因素，前3者低表達，后者高表達往往提示胃癌患者預后較差。

胃腫瘤；核仁小RNA；預后；基因表達譜；癌基因；因素分析，統計學

根據2015年的報告，2012年世界范圍內新發胃癌病例951 600例，死亡病例723 100例［1-2］。胃癌是致死率很高的惡性腫瘤，大多數的胃癌患者在中晚期才被發現，預后往往較差［3］。相同臨床分期和接受相似治療的患者臨床結局卻往往并不同［4］。因此，臨床需要更有效的預后生物標志物來提供更精準的預后評估。核仁小RNA（snoRNA）是一類結構原件相對保守的非編碼RNA，長度約是60～300個核苷酸［5-6］。有研究發現，snoRNA U50在乳腺癌和前列腺癌細胞中有降表達或基因缺失的情況［7］；snoRNA很可能參與了腫瘤的生長和轉移過程［8-10］。一些snoRNA還被發現與腫瘤臨床病例特征和預后相關［11］。然而，有關snoRNA在胃癌發生發展過程中的作用研究尚少見。本研究檢測了90例胃癌患者snoRNA的表達情況，旨在揭示snoRNA的表達與胃癌預后間的關聯，以期發現新的胃癌預后標志物，為準確評估胃癌預后提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2001年11月—2009年11月在天津醫科大學腫瘤醫院確診的胃癌病例90例，男59例，女31例，年齡（58.4±11.6）歲，其中 58歲46例，＞58歲44例；吸煙37例，不吸煙53例；飲酒24例，不飲酒66例。所有病例都經過病理學確診。腫瘤位于胃上1/3者59例，中下2/3者31例；臨床分期在Ⅰ～Ⅱ期者41例，Ⅲ～Ⅳ期者49例；胃癌組織學低分化者67例，中高分化者23例。本研究經過天津醫科大學倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。

1.2隨訪隨訪起始時間為患者確診為胃癌的時間，截止時間為2015年3月31日，隨訪時間1.5～147.5個月，中位隨訪時間為34.1個月，截至最后1次隨訪，55例發生復發或轉移，有55例患者死于胃癌，15例失訪?？偵鏁r間（OS）定義為從患者確診為胃癌到患者死于胃癌，失訪、健在以及患者死于其他疾病定義為刪失。無進展生存時間（PFS）為從患者確診為胃癌到患者發生復發或轉移的時間，失訪或未發生復發轉移定義為刪失。

1.3 snoRNA表達留取90例患者的胃癌組織，在液氮中保存。依據標準操作流程，用TRIzol（英杰公司）法提取癌組織的總RNA。采用NanoDrop儀器，通過分析光密度（OD）260/280和OD260/230的值對RNA的濃度和質量進行質控。應用基因芯片（Affymetrix公司）分析90例癌癥患者405種snoRNA的表達譜。表達譜結果依據Gene Titan設備（Affymetrix公司）操作流程來讀取。根據中位表達量把snoRNA的表達分為高表達（ 中位數）和低表達（＜中位數）。應用Kaplan-Meier法和Log-rank法進行單因素生存分析。用多因素Cox比例風險模型進行多因素生存分析。

1.4 snoRNA危險評分及生存情況經多因素分析后，對患者預后在不同表達組間存在差異的snoRNA進行危險度評分，把每個snoRNA高低表達組中預后較差的組（危險因素）評分為“1”，較好的組（保護因素）評分“0”。每個snoRNA的評分進行相加，得到最終的危險評分，把評分為“0”定義為低危組，評分“1”、“2”和“3”定義為中危組，評分為“4”定義為高危組，分析不同危險評分組的生存情況。將患者的性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒、組織學分級（中高分化組和低分化組）、腫瘤大?。ǎ? cm組和 5 cm組），腫瘤位置（上1/3組和中下2/3組）以及臨床分期（Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ期組）納入多因素生存分析。

1.5統計學方法生存分析應用SAS 9.0和SPSS 13.0軟件計算，生存曲線采用SPSS 13.0軟件繪制，森林圖應用Stata 12.0軟件繪制，P＜0.05為差異有統計學意義。Cox影響因素分析取P＜0.01為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 snoRNA的表達與胃癌預后的關聯19種snoRNA在高、低表達者間的OS或PFS差異有統計學意義。U17b（中位表達量M=5.58）、ACA61（M= 4.25）、U78（M=6.19）、ACA27（M=4.02）、ACA48（M= 4.55）、ACA67（M=4.10）、U36A（M=4.06）和ENSG00000212214（M=4.00）低表達者的OS短于高表達者，ACA49（M=4.03）、mgU6-53（M=4.05）、14qII-3 （M=4.23）、14qII-14（M=4.17）、14qII-26（M=4.05）、HBII-85-29（M=4.23）、U8（M=4.59）、U91（M=4.56）、HBII-336（M=4.26）、ENSG00000206898（M=3.99）和ENSG00000212500（M=3.98）低表達者的OS長于高表達者（P＜0.05）。U17b、ACA61、ACA27、ACA48、ACA67、U36A和ENSG00000212214低表達者的PFS短于高表達者，ACA49、mgU6-53、14qII-14、14qII- 26、HBII- 85- 29、U8、U91、HBII- 336、ENSG00000206898和ENSG00000212500低表達者的PFS長于高表達者（P＜0.05），見表1。

2.2總生存和無進展生存的影響因素分析結果以19種snoRNA（低表達=0，高表達=1）為自變量，以總生存結局（生存或失訪=0，死于胃癌=1）、無進展生存（無復發轉移或失訪=0，復發轉移=1）為因變量，分別進行Cox影響因素分析示，ACA61、ACA27和U36A高表達的患者總生存以及無進展生存較好（P＜0.01），而ENSG00000206898高表達的患者總生存及無進展生存較差（P＜0.01）；14qII-26、U91高表達者無進展生存較差（P＜0.01），但總生存差異無統計學意義，見表2、3。

2.3 4種snoRNA的表達與胃癌預后的關系分析見圖1。以年齡（歲： 58=0，＞58=1）、性別（男性=0，女性=1）、是否吸煙（否=0，是=1）、是否飲酒（否=0，是= 1）、組織學分化（中高分化=0，低分化=1）、腫瘤位置（上1/3=0，中下2/3=1）、臨床分期（Ⅰ期～Ⅱ期=0，Ⅲ期～Ⅳ期=1）、snoRNA危險評分（低危組=1，中危組= 2，高危組=3）為自變量，總生存結局（生存和失訪= 0，死亡=1）和無進展生存結局（無復發轉移和失訪= 0，發生復發轉移=1）為因變量。分別行Cox回歸分析顯示，snoRNA危險評分是胃癌患者總生存和無進展生存的獨立影響因素。

Tab.1 Univariate analysis of the expression of snoRNAs and prognosis in patients with gastric cancer表1　SnoRNA表達與胃癌預后的單因素生存分析

Tab. 2 Multivariate Cox proportional hazard model analysis of the expression of snoRNAs and overall survival rate of gastric cancer patients表2　snoRNA表達與胃癌患者總生存的多因素分析

Tab.3 Multivariate Coxproportionalhazard modelanalysis oftheexpressionofsnoRNAsand progression-freesurvivalrate表3　snoRNA表達與胃癌患者無進展生存的多因素生存分析

A：總生存的生存曲線和森林圖；B：無進展生存的生存曲線和森林圖Fig. 1 Survival curves and cox model forest map of four kinds of snoRNAs in gastric cancer patients圖1　4種snoRNA與胃癌患者的生存曲線和Cox模型的森林圖

3　討論

在日常臨床實踐中，TNM分期是評估胃癌預后的主要指標，對治療方案的選擇起著重要作用［3］。但近來研究證實一些癌基因、小分子RNA（miRNA）表達異?；颊叩念A后表現并不同，提示現有的預后評估系統還不夠完善［4，12］。本研究用snoRNA的表達水平差異來評估胃癌患者的預后。snoRNA被認為對于核糖體RNA（rRNA）的轉錄后修飾有重要作用［9］。近來很多研究報道了snoRNA參與癌癥進展過程［10］。SNORD48和SNORD4在不同分期下的乳腺癌和非小細胞肺癌中表達存在差異［11］，而在胃癌中表達如何還鮮有報道。有研究認為，snoRNA及其宿主基因可能通過不同的通路參與腫瘤的轉移過程，或snoRNA本身能被進一步加工成功能近似miRNA的小RNA而發揮作用［8］。miRNA在癌癥的復發轉移過程起著重要作用，而snoRNA源性的小RNA也很有可能在癌癥進展過程中產生積極作用。一些snoRNA能夠控制轉移驅動基因的拼接來調控腫瘤的轉移［13］。此外，還有研究發現，snoRNA能作為代謝應激的介質來影響癌癥的進展［14］。

本研究應用基因芯片技術檢測胃癌患者snoRNA的表達并分析其對胃癌預后的影響。結果顯示，ACA61、ACA27和U36A高表達的患者總生存及無進展生存較好，而ENSG00000206898高表達的患者總生存及無進展生存較差，這4種snoRNA是預測胃癌預后的獨立影響因素，其中，ACA61位于1p35.3，ACA27位于13q12.2，U36A位于9q34，ENSG00000206898位于20p13，ACA61、ACA27和U36A的靶標分別是18S rRNA和28S rRNA，而ENSG00000206898是一種孤兒snoRNA，孤兒snoRNA靶向rRNA尚不確定，因此，孤兒snoRNA的存在，為snoRNA能夠參與多種重要生物學功能調節增加了可能性［15-17］。此外，U36A的宿主基因為RPL7a［15，18］。有研究報道，RPL7a與trk原癌基因重組可形成嵌合癌基因trk-2h，進而編碼對應的癌基因蛋白［19-21］。

一般情況下，TNM分期提供的主要是解剖學方面的信息，而本研究更多涉及胃癌的分子生物學領域，通過對其分析可以為胃癌患者提供更為個體化的治療方案。但本研究對象僅為中國人群，而中西方對于胃癌患者的預后和治療方案存在差異［22］。所以，后續研究仍然需要納入更多非亞裔人群樣本來驗證。此外，本研究主要關注的是snoRNA的表達對于胃癌預后的影響，若能綜合分析所有非編碼RNA的作用也許能得到更準確的結論。

綜上，ACA61、ACA27、U36A和ENSG00000206898可以聯合作為胃癌預后的生物標志物，有望據此為胃癌患者提供個體化治療方案，但其作用機制還有待于進一步研究。

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（2015-12-08收稿2016-01-19修回）（本文編輯陸榮展）

The association between snoRNA profiles and prognosis in patients with gastric cancer

HAN Lu，SONG Fengju，HUANG Yubei，ZHENG Hong，CHEN Kexin
Department of Epidemiology and Biostatistics，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China Corresponding Author E-mail：chenkexin@tjmuch.com

Objective To identify snoRNA，which may be related to prognosis of gastric cancer. Methods Ninetygastric cancer patients who diagnosed at Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital were randomly collected in this study，and their clinical datawere followed up. A total of 405 snoRNA expression profiles were analyzed in 90 gastric cancer patients. Patients were classified as "low expression" group or "high expression" group accordingto the median expression of each snoRNA expression，which was calculated by univariate and multivariate survival analysis. We also screened out the snoRNAs，in which patients were survived differently. Patients were classified as high，middle，or low risk groups based on the snoRNA risk score. Values of age，gender，smoking，drinking，histological differentiation（well，moderately-differentiated and poorly differentiated），clinical stage（Ⅰ+Ⅱstage andⅢ+Ⅳstage），tumor size（＜5 cm and 5 cm），tumor location（upper 1/3 and others）and snoRNA risk score（high，middle，and low risk group）were assessed by multivariate Cox analysis. Results There were significant differences in overall survival and（or）progression-free survival rates in 19 patients with high and low snoRNAs expressions（P＜0.05）. Results of multivariate Cox analysis showed that patients with high expression of ACA61，ACA27 and U36A showed ahigher overall survival and progression-free survival rates，while patients with high expression of ENSG00000206898 showed a lower overall survival and progression-free survival survival rates（P＜0.01）. SnoRNA risk score is an independent prognostic factor for patients with gastric cancer. Compared with low risk group，patients in middle risk group and in high risk group showed ashorter overall survival and progression-free survival rates（P＜0.001）. Conclusion The expressions of ACA61，ACA27，U36A and ENSG00000206898 are independent prognostic factors of gastric cancer. Low expressions of the first three indexes and high expressions of the last one predict abad prognosis.

gastric neoplasms；RNA，small nucleolar；prognosis；gene expression profiling；oncogenes；factor analysis，statistical

R735.2

A

10.11958/20150384

2014教育部“創新團隊發展計劃”資助項目（IRT_14R40）

天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，腫瘤分子流行病與生物統計研究室（郵編300060）

韓璐（1989），女，碩士在讀，主要從事腫瘤分子流行病學研究

E-mail：chenkexin@tjmuch.com