高胰島素對MCF-7/ADR細胞化療敏感性的影響

朱楠楠，穆蘭，李代清

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高胰島素對MCF-7/ADR細胞化療敏感性的影響

朱楠楠1，穆蘭2，李代清1

目的分析高胰島素對MCF-7/ADR細胞P-糖蛋白（P-gp）表達和功能的影響，并初步探討胰島素對MCF-7/ADR細胞化療敏感性的影響。方法用不同胰島素濃度（0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μmol/L）的全細胞培養基干預MCF-7/ADR細胞，分別采用Real-time PCR法檢測細胞中P-gp mRNA表達，Western Blot法檢測細胞中P-gp蛋白表達水平，羅丹明123熒光實驗測定P-gp的外排功能變化，MTT法檢測MCF-7/ADR細胞活性及化療敏感性。結果0.10 μmol/L的胰島素可促進MCF-7/ADR細胞增殖，0.05及0.10 μmol/L濃度的胰島素可增加MCF-7/ ADR細胞P-gp mRNA及蛋白水平表達，并能增加P-gp的外排功能，降低MCF-7/ADR細胞對表阿霉素的化療敏感性。結論高濃度胰島素可能通過促進MCF-7/ADR細胞P-gp的表達和功能，增加乳腺癌細胞化療耐藥性，從而降低MCF-7/ADR細胞的化療敏感性。

胰島素；P糖蛋白；抗藥性，腫瘤；表柔比星；MCF-7/ADR細胞

細胞與分子生物學

近20年來，糖尿病發病率不斷增加［1］。最近有研究表明糖尿病患者中乳腺癌的發病率較高［2］，糖尿病治療藥物也可能影響乳腺癌患者的預后［3-4］。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是abcb1編碼的膜轉運蛋白，是能量依賴性ATP超家族的一員［5-6］。P-gp是乳腺癌細胞抗癌藥物耐藥表型產生的原因，也是乳腺癌患者預后不良的原因［6-7］。胰島素主要用來調節糖尿病患者的高血糖癥狀，但胰島素對糖尿病乳腺癌患者P-gp的表達及化療耐藥性的影響尚不明確。本研究旨在分析胰島素對乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/ADR P-gp表達和功能的影響，并初步探討胰島素治療對MCF-7/ADR細胞化療敏感性的影響。

1材料與方法

1.1材料（1）MCF-7/ADR細胞及培養試劑。人乳腺癌細胞系MCF-7/ADR由天津醫科大學腫瘤醫院惠贈；胎牛血清、青霉素、鏈霉素、DMEM培養基、Trypsin胰蛋白酶等均為美國GIBCO公司產品；胰島素購自諾和諾德制藥有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自天津索羅門生物科技有限公司。（2）P-gp基因（abcb1）表達測定用試劑。E.Z.N.A總RNA分離試劑盒（美國OMEGA公司）；RT-PCR試劑盒（美國LIFE TECHNOLOGIES公司）；引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。（3）P-gp蛋白表達測定用試劑。SDS-PAGE微型電泳儀和轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；PVDF膜（天津博美科生物技術有限公司）；一抗Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb（C219）購自德國默克公司，一抗內參α-tublin抗體購自美國Abcom公司，二抗（羊抗鼠）購自美國proteintech公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司。（4）羅丹明123實驗。羅丹明123為美國GIBCO公司產品。（5）細胞活性實驗。表阿霉素購自美國輝瑞公司；噻唑藍（MTT）購自天津索羅門生物科技有限公司。

Tab. 1 The real time PCR oligonucleotide sequences表1　Real-time PCR引物序列

1.2方法

1.2.1 MCF-7/ADR細胞的培養及分組處理組分別用濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 μmol/L的胰島素孵育細胞，對照組用正常培養基培養，每組設5～6個平行孔，培養48 h。

1.2.2細胞活性實驗將生長狀態良好的細胞以1×104個/孔接種于96孔板，通過常用的MTT實驗來檢測細胞活性。用不同濃度的（0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μmol/L）胰島素處理細胞48 h后，再用MTT避光孵育4 h，最后用DMSO溶解終止實驗，用多功能酶標儀讀取490 nm下吸光度。

1.2.3 P-gp基因表達檢測用E.Z.N.A總RNA分離試劑盒提取細胞RNA，采用RT-PCR法檢測P-gp基因表達，以βactin為內參對照。反應體系均為20 μL，逆轉錄參數：65℃，5 min；42℃，1 h；70℃，5 min。PCR反應參數：95℃預變性15 s，60℃，30s，共40個循環；最終72℃延伸30s。采用Ct值法（2- Ct）分析abcb1基因的相對表達。其中 Ct=實驗組（Ct目的基因-Ct管家基因）-對照組（Ct目的基因-Ct管家基因）。

1.2.4 P-gp蛋白表達檢測收集細胞裂解液提取蛋白備用。用10%SDS-PAGE膠分離蛋白質，然后移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb （C219）一抗（1：50）孵育過夜，TBST液洗去一抗，以辣根過氧化物酶（HRP）連接的二抗（羊抗鼠1：5 000）孵育2 h，以增強化學發光法（ECL）試劑盒顯示免疫反應條帶。α-tublin作為內參對照。

1.2.5羅丹明123實驗通過檢測細胞內羅丹明123的積累來評估P-gp的外排功能。將細胞以1×104個/孔接種于96孔板，用不同濃度（0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μmol/L）的胰島素干預細胞48 h，然后用無血清的DMEM培養基洗滌細胞2遍，再用1 mg/L羅丹明123孵育細胞3 h。收集細胞后，用酶標儀在激發波長485 nm，發射波長535 nm下測定羅丹明123的熒光強度值。熒光強度值越低反映P-gp的外排功能越強。

1.2.6細胞化療敏感性實驗將生長狀態良好的細胞以1× 104個/孔接種于96孔板，通過常用的MTT實驗來檢測細胞對表阿霉素的化療敏感性。對照組正常培養基培養48 h，處理組用胰島素（0.10 μmol/L）孵育細胞48 h后，2組均再用不同濃度的表阿霉素（0、0.5、1、5、10、50 mg/L）處理48 h，然后用MTT避光孵育4 h，最后用DMSO溶解終止實驗，用多功能酶標儀在490 nm下讀取吸光度。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析，計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析（One-way ANOVA）進行比較，方差分析后組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胰島素對MCF-7/ADR細胞活性及P-gp的影響與對照組比較，0.10 μmol/L胰島素可增加MCF-7/ADR細胞活性（P＜0.05）；RT-PCR結果顯示，0.05、0.10 μmol/L胰島素組P-gp基因表達上調（P＜0.05）；Western Blot結果顯示，0.05、0.10 μmol/L胰島素組P-gp蛋白表達上調（P＜0.05）；羅丹明123外排實驗結果顯示，0.05、0.10 μmol/L胰島素組P-gp外排功能增強（P＜0.05），見表2、圖1。

2.2胰島素對MCF-7/ADR細胞化療敏感性的影響與對照組比較，0.10 μmol/L胰島素可增加不同濃度（0、0.5、1、5、10、50 mg/L）表阿霉素干預的MCF-7/ADR細胞活性，降低MCF-7/ADR細胞的化療敏感性，見表3。

Tab. 2 The effects of insulin on cell viability and P-gp inMCF-7/ADR cells表2　胰島素對MCF-7/ADR細胞活性及P-gp的影響

Fig.1 The effects of insulin on the expression of P-gp of MCF-7/ADR cells圖1　胰島素對MCF-7/ADR細胞P-gp表達的影響

Tab. 3 The effects of insulin on chemotherapeutic sensitivity of MCF-7/ADR cells under different concentration of epidoxorubicin表3　不同濃度表阿霉素作用下胰島素對MCF-7/ADR細胞化療敏感性的影響?。╪=6，x±s）

3　討論

多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）是指腫瘤細胞長期接觸某一化療藥物時，不僅會產生對此種化療藥物耐藥性，而且可對其他結構和功能不同的多種化療藥物產生交叉耐藥性［8］。與MDR相關的蛋白可通過外排藥物有效地降低細胞內大量藥物的積累和毒性［9］。其中，P-gp的作用最重要，其在腫瘤治療中能外排多種化療藥物，且與MDR有關［10］。

胰島素主要用來調節糖尿病患者的高血糖癥狀，但關于胰島素對癌細胞P-gp影響的研究很少。本研究發現，胰島素能夠增加MCF-7/ADR細胞P-gp的表達和功能，降低表阿霉素對MCF-7/ADR細胞的毒性；而Wei等［11］發現，胰島素能夠增加胃癌細胞P-gp的表達，促進其細胞生長，并降低5-氟脲嘧啶對細胞的毒性。另外，Liu等［12］研究認為長期使用胰島素會增加腦微血管內皮細胞P-gp的表達和功能；胰島素治療也能增加糖尿病大鼠腦紋狀體毛細血管P-gp的表達［13］。這些研究均與本研究結果一致，說明胰島素能促進P-gp的表達及藥物外排功能并降低抗腫瘤化療藥物的療效。本研究還發現，胰島素能增加MCF-7/ADR細胞活性，與Gallagher等［4］的研究結果相似，他們認為胰島素可通過激活胰島素受體促進乳腺癌細胞生長、分裂，表明胰島素可促進乳腺癌細胞增殖。此外，Bowker等［14］的臨床研究發現，胰島素治療的2型糖尿病患者癌癥相關病死率明顯增高；胰島素在乳腺癌特別是三陰性乳腺癌的發生發展中起到重要作用［15］。但Nawa等［16］發現，在糖尿病小鼠回腸中，胰島素使P-gp的表達和功能明顯下降。Yeh等［17］發現胰島素對腎的P-gp表達卻無影響。這與本研究結果不一致，原因可能是胰島素對不同的組織或細胞的影響不同。目前關于胰島素引起P-gp變化的機制研究較少。Liu等［18］研究認為在小鼠腦微血管內皮細胞中，胰島素可通過胰島素受體介導的蛋白激酶C（PKC）/核因子（NF）-κB通路增加P-gp的表達。

本研究僅進行了體外實驗，且未進行相關機制探討，而此前類似研究較少，因此尚無明確證據表明胰島素能降低乳腺癌患者化療敏感性。胰島素常用于治療2型糖尿病，尤其是伴隨嚴重并發癥的患者。但目前為止，鮮見大規模研究明確胰島素對腫瘤患者化療療效的影響。故本研究僅提示高胰島素可能通過增加P-gp的表達和功能促進MCF-7/ADR細胞的MDR，從而降低乳腺癌細胞化療敏感性。今后需要更多的研究來探討胰島素對乳腺癌化療患者化療敏感性的影響及其相關機制。對于糖尿病乳腺癌患者的治療，有必要考慮胰島素對P-gp的影響，從而減少不良預后的發生。

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（2015-10-22收稿2015-11-12修回）（本文編輯李國琪）

Effects of high insulin on chemotherapeutic sensitivity in MCF-7/ADR cells

ZHU Nannan1，MU Lan2，LI Daiqing1
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy，Ministry of Education，Tianjin Medical University Corresponding Author E-mail：Daiqingli68@163.com

Objective To analyse the effects of high insulin on the expression and function of P-glycoprotein（P-gp），and preliminarily investigate the influence of insulin on chemotherapeutic sensitivity in MCF- 7/ADR cells. Methods MCF-7/ADR cells were cultured with different concentrations of insulin（0.001，0.005，0.01，0.05 and 0.1 μmol/L）. Realtime PCR was used to detect the expression of P-gp mRNA. Western blot assay was used to detect the expression level of P-gp. Rhodamine 123 was used to detect the efflux function level of P-gp. Cell viability and chemotherapeutic sensitivity were detected by MTT assay. Results High concentration of insulin（0.1 μmol/L）promoted the proliferation of MCF-7/ADR cells. The concentration of insulin（0.05 and 0.1 μmol/L）accelerated P- gp mRNA and protein expression，which also augmentedthe effluxfunctionof P-glycoproteinandreducedthe chemotherapeutic sensitivitytoepirubicin. Conclusion High concentration of insulin may influence the drug resistance of breast cancer cells by promoting the expression and function of P-glycoprotein of MCF-7/ADR cells.

insulin；P-glycoprotein；drugresistance，neoplasm；Epirubicin；MCF-7/ADR cell

R737.9

A

10.11958/20150257

國家自然科學基金資助項目（81472472）

1天津醫科大學代謝病醫院，衛生部激素與發育重點實驗室（郵編300070）；2天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室

朱楠楠（1990），女，碩士在讀，主要從事糖尿病治療對腫瘤耐藥影響方面研究

E-mail：Daiqingli68@163.com