人FOXA1蛋白的原核表達、純化及蛋白互作分析

譚擁軍 陳竹林++陳團輝++向勤??

摘要：構建FOXA1的原核表達載體，誘導表達并純化后獲得人FOXA1的C端和N端蛋白片段，為尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎.提取人乳腺癌細胞MCF7的總RNA，逆轉錄成cDNA，設計引物PCR克隆FOXA1的cDNA，再以此為模板擴增FOXA1的C端、N端cDNA片段，分別并克隆進帶有GST標簽的原核表達載體pGEX4T1，構建重組表達質粒.雙酶切及測序鑒定正確后，轉化至大腸桿菌BL21 Rosetta DE3，經IPTG誘導，Glutathione Sepharose 4B親和純化，通過SDSPAGE電泳及Western blot確定FOXA1蛋白的表達.與MCF7細胞裂解液孵育，進行GSTPull down試驗，檢測純化蛋白與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功構建pGEX4T1FOXA1C和 pGEX4T1FOXA1N的原核表達載體；在大腸桿菌中誘導目的蛋白表達；經Glutathione Sepharose 4B純化后，獲得了人FOXA1的C端蛋白片段GSTFOXA1C與N端蛋白片段GSTFOXA1N；證實GSTFOXA1C能與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.

關鍵詞：轉錄因子FOXA1；原核表達；相互作用蛋白

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A

轉錄因子FOXA1屬于叉頭框（Forkhead Box， Fox）轉錄因子家族的FOXA亞家族[1].FOX基因廣泛地分布于從酵母到人的各種真核生物中，構成一個龐大的轉錄因子家族.其中在哺乳動物中就擁有40個以上成員，分別參與細胞分化、增殖、代謝及細胞凋亡等生理過程的調節[2]. FOXA1是該家族最早被克隆的成員[3].

FOXA1蛋白介導許多蛋白的相互作用，調節發育、代謝和腫瘤的發生.FOXA1的功能區域由 DNA結合區和轉錄激活區構成.作為先鋒轉錄因子，FOXA1的羧基端能與核心組蛋白H3，H4相互作用[4] 加強了FOXA1蛋白與核小體的結合能力.有研究表明轉錄因子FOXA1 羧基端的轉錄激活區可以招募TLE3/GRG3結合到染色質上[5].而FOXA1 DNA結合區可以干擾轉錄因子NKX2.1與DNA的結合功能從而抑制NKX2.1轉錄復合物的形成，抑制腦肺和甲狀腺的發育[6].此外，FOXA1的DNA結合區還介導FOXA1與雄激素受體（AR）的相互作用[7]，而在乳腺癌細胞株中，雌激素的應答在一定程度上依賴于FOXA1的表達[8-9].

為了進一步研究FOXA1在細胞中扮演的角色，本研究通過基因工程技術體外構建表達載體，誘導可溶性融合蛋白 GSTFOXA1C和GSTFOXA1N 的高效表達并親和純化.利用 GSTPull down技術，在乳腺癌細胞MCF7中證實GSTFOXA1C可與已知的FOXA1結合蛋白TLE3發生相互作用，證明純化蛋白結構正確且能與其互作蛋白發生互作，為進一步尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎.

1材料與方法

1.1菌種、質粒、細胞系

大腸桿菌DH5α感受（北京鼎國），大腸桿菌BL21 Rosetta（DE3）感受態（廣州百恩維），質粒pGEX4T1由本實驗室保存，乳腺癌細胞MCF7為本實驗室凍存.

1.2主要試劑

限制性內切酶BamHI，XhoI，T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司，MMLV逆轉錄酶購于Promega公司，DNA高保真聚合酶購于TOYOBO公司，PCR 引物由上海生工生物公司合成，Glutathione Sepharose 4B購于GE，GST抗體購于碧云天，V5抗體購于Millpore公司.

1.3重組質粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的構建及其鑒定

根據NCBI檢索到的人源FOXA1的cDNA序列以及空載體PGEX4T1的多克隆位點確定FOXA1的上下游引物如表1所示.上游引物為CCC GGA TCC ATG TTA GGA ACT GTG AAG，下劃線為BamH I 酶切位點，下游引物為CGC TCT AGA GGA AGT GTT TAG GAC GGG，下劃線為EcoR I 酶切位點.以人的乳腺癌細胞MCF7提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為94 ℃ 2 min ；98 ℃ 10 s，68 ℃ 90 s，68 ℃ 10 min，32個循環.將 PCR產物克隆入pGEX4T1質粒中，雙酶切鑒定后送上海生工測序.以測序正確的pGEX4T1FOXA1為模板，FOXA1C上游引物GCG CGA ATT CAA CCA CCC GTT CTC CAT CAA，FOXA1C下游引物GCG CCT CGA GTC ATT GGT AGT ACG CCG GCT CCA G；FOXA1N上游引物GCG CGA ATT CAT GTC CTA GGC CAA CCC GG，FOXA1N下游引物GCG CCT CGA GCT AGG CGT GCG GGT AGC TGC GC.分別克隆FOXA1的C端（第397到第461個氨基酸）、N端（第66到第218個氨基酸）.

1.4GSTFOXA1C，GSTFOXA1N融合蛋白的純化及其鑒定

將測序正確的pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C轉化入BL21 Rosetta DE3感受態細胞，挑取陽性單克隆，加入含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養基中，37 ℃，培養至OD值在0.6～1.0之間，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，32 ℃誘導4 h后收集菌液，溶菌酶酶解30 min，超聲破碎，取上清加入GSTbeads室溫孵育30 min后，加入Elution Buffer洗脫，收集洗脫后的蛋白，考染和免疫印跡鑒定.

1.5GST pull down

MCF7細胞培養至60%～90%時，脂質體轉染帶V5標簽的TLE3真核表達質粒，48 h后收集轉染后的細胞，加入500 μL IP裂解液冰上裂解1 h，13 000 r/min，4 ℃，離心15 min，收集上清，即為總的細胞裂解液.向收集的細胞裂解液中加入20 μL GSTbeads，4 ℃，孵育2 h，離心收集上清，一分為二，分別加入20 μL GSTbeads和純化后的GSTFOXA1C，GSTFOXA1N蛋白，4 ℃旋轉結合2 h，4 000 r/min離心收集珠子，用預冷的GST Lysis Buffer漂洗3次，加入Elution Buffer洗脫，收集洗脫后的蛋白，進行考染和免疫印跡鑒定.

2結論

2.1人FOXA1基因全長的擴增

MCF7細胞 RNA的提取按照Total RNA KitI試劑盒（Omega，USA）進行，運用MMLV逆轉錄酶（Invitrogen，USA）將RNA反轉錄為cDNA.通過NCBI查詢人FOXA1的cDNA序列設計一對引物，再以cDNA為模板PCR擴增人的FOXA1全長（圖1）所示，通過PCR擴增出來的FOXA1 cDNA大小為1 400 bp左右，與NCBI查詢的大小基本一致.

2.2重組質粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的構建

再以此為模板擴增FOXA1C/FOXA1N，大小分別為196 kb，459 kb，與預期大小一致.將PCR克隆獲得的片段克隆至表達載體PGEX4T1，進行雙酶切鑒定如圖2所示.我們已經討論了FOXA1的結構域蛋白在生物體內發揮了重要作用，為了進一步研究其在生物體內的功能，所以克隆出人FOXA1的羧基端和氨基 端蛋白，為后續試驗奠定材料基礎.

2.3GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白的表達及鑒定

將pGEX4T1，pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C 3個質粒分別轉化進BL21 Rosetta DE3感受態細胞，挑取陽性克隆大規模培養，經IPTG誘導后，收集菌液，Western blot法檢測顯示，GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白均能有效表達（圖3）.

2.4GSTFOXAC與GSTFOXA1N融合蛋白的純化

將pGEX4T1，pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C 3個質粒分別轉化進BL21 Rosetta DE3感受態細胞，挑取陽性克隆大規模培養，經IPTG誘導后，收集菌液，酶解，超聲破碎.上清用GSTSepharose4B親和珠純化后，經考馬斯亮藍染色結果顯示，雖出現不同程度的降解，但均能有效地獲得較高濃度的目的GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白（圖4）.

2.5GSTpull down結果分析

將帶有GSTFOXA1C與GSTFOXA1N融合蛋白的珠子與過表達的V5TLE3蛋白的MCF7細胞裂解液孵育后，用V5抗體進行Western blot 法檢測（圖5）結果顯示，GSTFOXA1C融合蛋白可以與TLE3 蛋白發生結合，而GST蛋白和GSTFOXA1N融合蛋白在同一位置無此條帶，說明FOXA1C端蛋白結構域能夠有效的與TLE3 蛋白特異地相互作用，具有與FOXA1全長蛋白部分相似的生物學功能.

1：過表達V5TLE3蛋白的MCF7細胞裂解物（Input）；2：GST蛋白與Input孵育后的Pull down產物；3：GSTFOXA1N融合蛋白與Input孵育后的Pull down產物；4：GSTFOXA1C融合蛋白與Input孵育后的Pull down產物

2.6Pull down結果的考馬斯亮藍分析

將帶有GSTFOXA1C融合蛋白的珠子與MCF7細胞裂解液孵育后，同時用GST蛋白與MCF7細胞裂解液孵育的結果作為對照，再用洗脫液將Pull down產物洗脫下來，經考馬斯亮藍染色發現，GSTFOXA1C融合蛋白能夠拖下許多與FOXA1C端相結合的互作蛋白，從而為后面的實驗奠定材料基礎（圖6）.

1：Protein Maker；2：Input：MCF7 cell lysis；3：對照組GST Pull down 洗脫產物；4：對照組 GST Pull down 上清；5：實驗組GSTFOXA1C Pull down洗脫產物；6：實驗組GSTFOXA1C洗脫上清；7：GSTFOXA1C蛋白；8：GST蛋白

3討論

GST Pull down技術是體外確定兩個已知蛋白是否相互作用以及篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白的有效方法. 本實驗成功構建GSTFOXA1結構域蛋白的表達載體，這種構建基因的某一段的結構域蛋白研究其生物功能并不少見，有文章報道過構建轉錄因子FOXO基因的結構域蛋白研究它與目的蛋白的甲基化作用[10].再摸索誘導條件后以比較優化的條件誘導出GSTFOXA1C和GSTFOXA1N融合蛋白，作為后續試驗的誘餌蛋白.將高表達V5TLE3的MCF7細胞裂解液中與GSTFOXA1C誘餌蛋白以最佳時間孵育后，成功捕捉與其已知的結合蛋白TLE3，證實實驗制備的融合蛋白具有生物活性.隨后再次在MCF7裂解中以GSTFOXA1C為誘餌蛋白進行GST Pull down，將產物進行SDSPAGE后考馬斯亮藍染色發現成功捕捉到相互作用的蛋白.

FoxA1是Fox轉錄因子家族中的一員，該轉錄因子屬于“螺旋轉角螺旋”類蛋白的一個亞群.Fox家族蛋白功能涉及胚胎發育、細胞周期調控、糖類和脂類代謝、生物老化、免疫調節等多種生物學過程， 其突變和表達異常與發育畸形、代謝性疾病以及腫瘤發生有關[11-12].已有文章得出結論FOXA1與TLE3在乳腺癌中相互作用，本文通過進行GST Pull down成功驗證這一結論并證實制備的蛋白具有生物活性.

TLE基因最早在1968年被發現，現已知的家族成員共有19個[13]，是典型的轉錄輔助抑制因子家族蛋白.在哺乳動物中，它包括TLE（transducinlike enhancer of split）1～4（人類）.Gro / TLE蛋白家族不能直接與DNA結合，而是被各種不同類型的轉錄因子所招募[14].有研究證實轉錄因子FOXA1 羧基端的轉錄激活區可以招TLE3/GRG3結合到染色質上.本實驗通過利用GSTFOXA1C與TLE3的體外相互作用驗證兩者相互作用.

乳腺癌現已成為人類的一大殺手，越來越多的研究證明FOXA1在乳腺癌中發揮了重要的作用，使其有望成為腫瘤治療的新靶點[15-16].本文成功克隆了人的FOXA1，FOXA1C，FOXA1N基因并獲得有活性的人FOXA1C和FOXA1N蛋白，為后續進一步尋找FOXA1的互作蛋白和制備抗體奠定了良好的基礎.

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