內標法和外標法在測定己酸菌發酵液己酸含量中的應用

楊牢記，賓艷南，徐敏銳，陳興杰，謝國排，張寶年，程　偉，黃訓端，張部昌（安徽大學金種子酒業產業技術研究院，安徽合肥230601）

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內標法和外標法在測定己酸菌發酵液己酸含量中的應用

楊牢記，賓艷南，徐敏銳，陳興杰，謝國排，張寶年，程偉，黃訓端，張部昌
（安徽大學金種子酒業產業技術研究院，安徽合肥230601）

摘要：采用氣相色譜內標法和外標法測定己酸菌發酵液的己酸含量，并進行比較分析。結果表明，內、外標法的定量方法在線性范圍內呈線性關系，可決系數R2＞0.99，且具有良好的精密度和穩定性，RSD＜5%。兩種方法均滿足己酸發酵液中己酸檢測的要求，但內標法的R2、精密度和穩定性方面均優于外標法，外標法在樣品處理和進樣中操作要求更高。將內、外標法應用于己酸菌發酵液中己酸含量的檢測，經F檢驗和t檢驗，兩種方法測得結果并無顯著性差異。

關鍵詞：己酸菌；己酸；內標法；外標法；白酒

優先數字出版時間：2016-03-24；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1211.005.html。

己酸菌是重要的窖泥產酸功能菌，其代謝產生的己酸與大曲發酵產生的酒精生成己酸乙酯，是濃香型白酒的特征風味物質，決定著白酒的質量及風格［1］。采用儀器分析己酸含量是人們認識己酸菌產酸能力的重要手段。由于己酸菌發酵液的含水量高和高鹽特性使其樣品不能直接進行氣相色譜檢測，在樣品處理上，除采用頂空法采集［2-5］，還可以考慮將發酵液除水和除鹽后再進行氣相色譜檢測。在萃取劑中，乙醚具有較高的己酸萃取能力，采用乙醚萃取法可將不溶于有機物的鹽類物質和水去除［6-7］。

內標法是通過內標物與待測組分的峰面積比值進行計算，可消除進樣量的變化、色譜條件的微小變化等引起的誤差，內標法可進行多點校正也可進行單點校正，既適用于大量樣品也適用于少量樣品的測定。但是內標法需加入準確量的內標物，操作程序較麻煩。外標法相對于內標法操作簡便，不需加入內標物質，只需繪制好標準工作曲線后進行測定，再根據標準工作線可直接讀出己酸含量，標準工作曲線在檢測一段時間后可通過單點校正。由于每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應性能、柱溫度、進樣量、柱效等）很難完全一致，外標法檢測的準確性不及內標法。

本研究以己酸為研究對象，同時采用內標法和外標法測定己酸菌發酵液中的己酸含量，通過己酸測定結果的比較與分析，為己酸菌產酸性能檢測提供支持。

1材料與方法

1.1材料

己酸菌JKY8-E40-1（1#）、JKY8-E40-2（2#）、JKY12-E37-1（3#）、JKY12-E37-2（4#）、JKY1-E208（5#）、JKY1-E215（6#）由課組從某酒廠窖泥中分離獲得。待測己酸菌發酵液由以上菌株在37℃下厭氧發酵7d獲得。

1.2儀器與試劑

2010型氣相色譜儀（日本島津公司）；氫火焰離子化檢測器（FID）；全自動進樣器；10μL自動進樣針（日本島津公司）；色譜柱：DB-FFAP色譜柱（30m×0.25 mm× 0.25μm，美國安捷倫公司）；超純水儀（美國Thermo Fisher公司）；各種規格移液槍（美國Rainin公司）；各種規格容量瓶。

己酸和內標物2-乙基丁酸為色譜純（西亞試劑公司）；乙醇和乙醚為分析純（國藥集團）。實驗過程中用水均為超純水。

1.3溶液的配制方法

1.3.1內標液的配制方法

準確稱取內標物2-乙基丁酸原液0.185 g于100mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至100mL，配制成1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內標液待用。

1.3.2己酸標準液待測樣品的制備

準確稱取己酸原液0.930 g于100mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至100mL，配制成9.30 mg/mL己酸標準液待用。

分別取9.30 mg/mL己酸標準液3mL、2mL、1mL、0.5mL、0.2mL、0.1mL于5mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至5mL，配制成5.58 mg/mL、3.72 mg/mL、1.86 mg/mL、0.93 mg/mL、0.37 mg/mL、0.19 mg/mL己酸標準液。

采用乙醚萃取法對己酸標準液進行處理。內標法己酸標準液：分別取不同濃度己酸標準液和1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內標液500μL于5mL容量瓶中，加乙醚定容至5mL，充分振蕩2min，以便待測物高效率進入乙醚相，靜置1min，吸取1.5mL上層乙醚溶液置于2mL樣品瓶中，由于乙醚的沸點較低易揮發，需使用完好無損的樣品小瓶蓋蓋緊，防止乙醚揮發。外標法己酸標準液：分別取不同濃度己酸標準液500μL于5mL容量瓶內，之后處理方法與內標法己酸標準液相同。

1.3.3己酸菌發酵液待測樣品的制備

內標法待測樣品的制備（乙醚萃取法）：取己酸菌發酵液（需經0.22μm微孔濾膜過濾）和1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內標液500μL于5mL容量瓶中，萃取方法與1.3.2部分相同；外標法待測樣品制備不需加入內標物，其他與內標法待測樣品制備方法相同。

1.4色譜條件

進樣口溫度240℃；柱箱起始溫度：100℃（1min）；升溫速率：10℃/min；柱溫終溫度：220℃（2min）；檢測器溫度250℃；氣體流量：氫氣40mL/min，空氣400mL/min，尾吹氣30mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比20∶1；進樣體積：1μL。

1.5工作曲線的繪制

內標法工作曲線：以己酸與2-乙基丁酸內標物的峰面積之比為縱坐標（A/Ai），己酸與2-乙基丁酸的含量之比為橫坐標作圖（C/Ci），得到內標工作曲線。根據己酸菌發酵液中己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比，即可利用內標工作曲線算出發酵液中己酸的濃度。

外標法工作曲線：以己酸的峰面積為縱坐標（A），己酸濃度為橫坐標（C），得外標工作曲線。根據發酵液中己酸的峰面積，即可利用外標工作曲線算出己酸的濃度。

2結果與分析

2.1專屬性試驗

按照1.3.3中方法制備待測樣品，然后將待測樣品以1.4色譜條件進行氣相色譜檢測。圖1中線1、2、3、4分別為2-乙基丁酸待測樣品、己酸待測樣品、己酸與2-乙基丁酸混合待測樣品和己酸菌發酵液與2-乙基丁酸混合待測樣品的氣相色譜圖。由圖1可知，內標物2-乙基丁酸出峰較己酸快，且無論是在己酸標準液待測樣品中還是己酸菌發酵液待測樣品中都可與己酸完全分離。

圖1專屬性分離氣相色譜圖

2.2內標法測定己酸方法的建立

2.2.1工作曲線

分別將5.58 mg/mL、3.72 mg/mL、1.86 mg/mL、0.93 mg/mL、0.37 mg/mL、0.19 mg/mL的己酸標準液按照內標法待測品制備方法進行處理，取以上6個濃度標準液待測品在1.4中的色譜條件下進行氣相色譜進樣，每個濃度做2個平行樣品，且每個待測樣品各平行進樣2次，分別取己酸和2-乙基丁酸4次峰面積的平均值。以己酸與2-乙基丁酸內標物的峰面積之比（A/Ai）為縱坐標，己酸與2-乙基丁酸的含量之比（C/Ci）為橫坐標作圖，見圖2，得到內標法工作曲線的回歸方程為y=0.5557x-0.005121 （R2=0.9993，n=6），線性范圍為0.19～5.58 mg/mL，線性良好。

圖2己酸濃度測定的內標法標準工作曲線

2.2.2精密度

在2mL小瓶中加入1.5mL的1.86 mg/mL己酸標準液待測品，用新的樣品小瓶蓋蓋緊，按1.4色譜條件連續進樣6次，每次進樣結束后都換上新瓶蓋，用己酸與2-乙基丁酸的峰面積比計算精密度，6次測定的結果RSD為1.30%（見表1），表明該方法精密度良好。

表1 1.86 mg/mL己酸標準液6次檢測中己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比

2.2.3穩定性

在0、3h、6h、9h、12h分別對3.72 mg/mL己酸標準液待測品按1.4色譜條件進行氣相色譜檢測，以己酸與2-乙基丁酸的峰面積比為依據，考察待測品的穩定性，計算出RSD為2.18%（見表2），結果表明，己酸待測品在12h內穩定。

表2 3.72 mg/mL己酸標準液不同時間檢測己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比

2.3外標法測定己酸方法的建立

2.3.1工作曲線

將6個不同濃度的己酸標準液按照外標法待測品制備方法進行處理，然后取以上6個濃度標準液待測品在1.4中的色譜條件下進行氣相色譜進樣，每個濃度做2個平行樣品，且每個待測樣品各平行進樣2次，分別取己酸4次峰面積的平均值為縱坐標，以濃度為橫坐標，見圖3，得到外標法工作曲線的回歸方程y=5.4147x+0.3666（R2= 0.9976，n=6），線性范圍為0.19～5.58 mg/mL，線性良好。

圖3己酸濃度測定的外標法標準工作曲線

2.3.2精密度

在2mL小瓶中加入1.5mL的1.86 mg/mL己酸標準液待測品，用新的樣品小瓶蓋蓋緊，按1.4色譜條件連續進樣6次，每次進樣結束后都換上新瓶蓋，用己酸的峰面積計算精密度，6次測定的結果RSD為4.47%（見表3），表明該方法精密度良好。

表3 1.86 mg/mL己酸標準液6次檢測中己酸峰的面積

2.3.3穩定性

在0、3h、6h、9h、12h分別對3.72 mg/mL己酸標準液待測品按1.4色譜條件進行氣相色譜檢測，以己酸的峰面積為依據考察待測品的穩定性，計算出RSD為4.19%（見表4），結果表明，己酸待測品在12h內穩定。

表4 3.72 mg/mL己酸標準液不同時間檢測己酸與2-乙基丁酸的峰面積之比

對內標法與外標法的標準工作曲線擬合決定系數、工作曲線斜率、精密度和穩定性進行比較［9］，內標法與外標法測得的精密度與穩定性的RSD均小于5%，滿足檢測的需要。通過比較發現，在可決系數R2、精密度和穩定性方面，內標法的RSD明顯小于外標法。

2.4己酸菌發酵液中己酸含量測定

2.4.1內標法測定結果

選取不同的己酸菌發酵液，按照1.3.3己酸菌發酵液待測樣品制備中內標法的要求進行處理，每個己酸菌發酵液做6個平行待測樣品進行氣相色譜檢測，每個進樣2次，取平均值，結果見表5。

表5發酵液中己酸含量內標法測定結果

2.4.2外標法測定結果

選取不同的己酸菌發酵液，按照1.3.3己酸菌發酵液待測樣品制備中外標法的要求進行處理，每個己酸菌發酵液做6個平行待測樣品進行氣相色譜檢測，每個進樣2次，取平均值，結果見表6。

表6發酵液中己酸含量外標法測定結果

2.4.3內標法與外標法實測結果比較與分析

己酸菌發酵液中己酸測定的內標法與外標法測定結果對比見表7。將同一樣品的內、外標法測得數據進行F檢驗及t檢驗，比較兩種方法檢測數據是否存在顯著性差異。首先進行F檢驗，F=Sd大2/Sd小2，查F檢驗臨界表，當自由度n=5，置信度為95%時，F（5，5）=5.05，實際F值均小于F（5，5），說明兩種方法測得數據的Sd差異不顯著，進而用t檢驗平均值間有無顯著性差異。t檢驗，查t檢驗臨界表，當自由度f=10，置信度為95%時，t（10，0.95）=2.228，實際t值均小于t（10，0.95），故內、外標法在檢測己酸含量方面無顯著性差異。

表7己酸菌發酵液中己酸內標法與外標法對比結果

3　結論

采用氣相色譜內標法與外標法對己酸菌發酵液中的己酸含量進行測定。首先建立內、外標法工作曲線，2種方法在線性范圍內具有良好的線性關系，R2＞0.99。通過連續進樣和不同時間點進樣，檢測2種方法的精密度和穩定性良好，RSD＜5%。內、外標法的定量方法均滿

足己酸含量的檢測要求，但內標法的可決系數R2、精密度和穩定性方面均優于外標法。采用F檢驗和t檢驗對內、外標法所測得己酸菌發酵液中己酸含量的結果進行比較，實驗中的F值和t值均小于臨界值，2種方法所得己酸菌發酵液中己酸含量的結果無顯著性差異，內、外標法都可用于己酸菌發酵液中己酸含量的檢測。但對內標法與外標法測定結果進行比較，發現相同樣品時，外標法所得含量普遍比內標法高?？赡艿脑蚴怯米鬏腿∫旱囊颐岩讱饣笠绯鰳悠菲?，使相同體積內的己酸量上升，所以在實驗過程中需使用完好無損的樣品小瓶蓋蓋緊，防止乙醚揮發；氣相色譜是通過進樣針自動進樣，但是進樣針的氣密性決定了進樣體積的精確度，易產生誤差。上述原因，致使外標法在可決系數R2、精密度和穩定性方面不及內標法［10-11］。因此，在實踐中采用外標法需要做到精確、規范化操作，這樣才能使檢測結果準確可靠。

參考文獻：

［1］熊俐，胡洋，劉俊，等.窖泥己酸菌的分離培養與誘變選育［J］.四川理工學院學報，2010，23（3）：324-327.

［2］Attaie R.Quantification of volatile compounds in goat milk Jack cheese using static headspace gas chromatography［J］.J Dairy Sci，2009，92：2435-2443.

［3］汪立平，徐巖，趙光鰲，等.頂空固相微萃取法快速測定蘋果酒中的香味物質［J］.無錫輕工業大學學報，2003，22（1）：1-6.

［4］雷安亮，鐘其頂，高紅波，等.靜態頂空-氣相色譜法測定葡萄酒中主要香氣成分研究［J］.中國釀造，2009（5）：147-151.

［5］Socaci SA，Socaciu C，Tofana M，et al.In-tube extraction and GC-MS analysis of volatile components from wild and cultivated sea buckthorn（Hippophae rhamnoides L.ssp.Carpatica）berry varieties and juice［J］，Phytochem Anal，2012，24：319-328.

［6］Jeon B S，Kim B C，Um Y，et al.Production of hexanoic acid from D-galactitol by a newly isolated Clostridium sp.BS-1［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，88：1161-1167.

［7］Choi K，Jeon B S，Kim B C，et al.In situ biphasic extractive fermentation for hexanoic acid production from sucrose by Megasphaera elsdenii NCIMB 702410［J］.Appl Biochem Biotechnol，2013，171：1094-1107.

［8］章安源，馮濤，陳玲，等.內標法和外標法測定氟尼辛葡甲胺注射液含量的比較分析［J］.試驗研究，2014（11）：3-5.

［9］黃誠，盧麗明，劉國平.內標法和外標法測定血液中乙醇含量的比較分析［J］.生命科學儀器，2008（6）：41-43.

［10］黃偉.清香型白酒中乙酸乙酯內標法與外標法的比較［J］.福建分析測試，2014，23（5）：37-40.

［11］邱凈英，梁光義，蔣品，等.高效毛細管電泳內標法與外標法含量測定的比較［J］.光譜實驗室，2012，29（5）：2616-2621.

Application of ISTD and ESTD in the Determination of Caproic Acid Content in Caproic Acid Bacteria Fermenting Liquid

YANG Laoji，BIN Yannan，XU Minrui，CHEN Xingjie，XIE Guopai，ZHANG Baonian，CHENG Wei，HUANG Xunduan and ZHANG Buchang
（Jinzhongzi Industrial Technology Research Institute，Anhui University，Hefei，Anhui 230601，China）

Abstract:In this study，gas phase chromatography internal standard method（ISTD）and external standard method（ESTD）were used respectively for the determination of caproic acid content in caproic acid bacteria fermenting liquid.The results showed that both methods displayed good linearity（R2〉0.99）within the concentration range，and good precision and stability（RSD〈5%）.However，R2，the precision and the stability of ISTD were better than that of ESTD，and ESTD had higher requirements in sample treatment and sampling operation.The results of ISTD and ESTD were examined via F-test and t-test，and there was no significant difference between ISTD and ESTD.

Key words:caproic acid bacteria；caproic acid；internal standard method；external standard method；Baijiu

中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）06-0078-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016039

基金項目：金種子人工窖泥快速培養技術研究（Y06099204）；安徽大學2015年百門精品素質課程“食品安全”建設項目（ZLTS2015233）。

收稿日期：2016-02-02

作者簡介：楊牢記，安徽亳州人，研究生，高級工程師，從事釀造技術項目管理與研究。

通訊作者：張部昌，男，安徽五河人，博士，教授，從事生物工程研究。