干細胞因子在嚴重燒傷大鼠腸組織中的表達

王永杰，嚴　珺，李　雷，尹　飛，盧日峰，郭　麗*

(1．吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，吉林 長春130021；2．吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033)

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干細胞因子在嚴重燒傷大鼠腸組織中的表達

王永杰1，嚴珺1，李雷1，尹飛2，盧日峰1，郭麗1*

(1．吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，吉林 長春130021；2．吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033)

摘要：目的觀察嚴重燒傷后不同時間大鼠小腸損傷情況以及干細胞因子(stem cell factor,SCF)在受損小腸組織的表達。方法Wistar雄性大鼠按照隨機原則分為5組，燒傷前組、嚴重燒傷模型1天組、2天組、4天組和對照組，每組6只。制備嚴重燒傷模型后，每天觀察并記錄大鼠一般狀態和體質量變化。HE染色觀察大鼠小腸組織病理組織變化，免疫組織化學和蛋白印跡法檢測SCF蛋白的表達。結果對照組體質量逐漸上升，而燒傷組大鼠體質量增長緩慢，至燒傷后2天和4天燒傷組體重顯著低于對照組(P<0.05)。HE染色結果顯示燒傷前小腸絨毛結構完整，排列整齊，細胞形態表現正常；燒傷組有不同程度損傷，如間質和固有層水腫，上皮細胞變性壞死，絨毛頂端囊狀間隙甚至脫落，燒傷后2天最嚴重。免疫組織化學和Western blot結果都顯示與燒傷前比較小腸組織燒傷后1天SCF表達減少，2天和4天有所回升(P<0.05)。結論嚴重燒傷可以導致大鼠小腸組織損傷，SCF在燒傷導致的大鼠腸道損傷中發揮著一定的作用。

關鍵詞：燒傷；腸損傷；干細胞因子

(ChinJLabDiagn,2016,20:0875)

燒傷是一種由火焰、高溫液體、放射線等因素導致的常見的外傷性疾病。我國將總燒傷面積30%以上以及燒傷深度三度且面積10%以上的定義為重度燒傷，這類燒傷會引起體液滲出和全身應激反應，治療不當會引發休克危及生命。目前臨床上以補充血容量，積極防治休克和繼發性感染，合理營養為主，療效欠佳。嚴重燒傷導致機體損傷的機制復雜，治療困難，死亡率高。研究者現在普遍認為燒傷后血管內皮細胞受損，血管通透性增加，導致有效血容量下降，機體維持心臟和大腦等重要臟器的血供，外周組織血供減少，胃腸道的血供下降最為明顯，損傷尤為嚴重[1]。干細胞因子在腸組織維持一定的濃度是保證胃腸道調控Cajal間質細胞生長發育，繁殖和功能維持的基礎[2,3]。干細胞因子缺乏可能導致自主腸蠕動障礙[4]，腸道T細胞增殖能力減少，免疫功能降低[5]。有研究報道干細胞因子在腎毒性血清性腎炎組織中表達有所增長[6]，而增高干細胞因子的表達有助于腦缺血再灌注后行動能力恢復[7]，改善糖尿病大鼠膀胱組織損傷[8]。干細胞因子在燒傷腸組織不同時間的表達情況仍不清楚，其在燒傷腸組織損傷中的作用機制尚未見報道。

本研究擬定通過檢測干細胞因子在嚴重燒傷大鼠小腸組織的表達，初步探討燒傷后腸道組織損傷與干細胞因子之間的關系，為后期研究提供基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物

雄性Wistar大鼠，體重在240-280 g，購于吉林大學實驗動物中心。

1.2實驗方法

1.2.1燒傷腸損傷動物模型建立將實驗大鼠按照隨機原則分為5組，燒傷前組，嚴重燒傷模型1天組、2天組、4天組和對照組(未做燒傷處理，跟蹤體重和一般狀態)，每組6只。用8%硫化鈉脫去大鼠背部被毛，溫水清洗干凈。12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，燒傷組大鼠背部20%體表面積皮膚浸入97±1℃熱水中18 s制作燒傷模型，并立即補充生理鹽水40 ml/kg·bw，做好保溫處理并隨時觀察大鼠狀態和復蘇情況，燒傷前組與對照組不作處理，大鼠自由地飲水和進食，每日觀察大鼠的一般狀態并記錄體質量。

1.2.2動物取材10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，頸椎脫臼處死，迅速取出腸組織。

1.2.3病理組織學觀察大鼠小腸組織10%中性甲醛溶液中固定，脫水、透明，石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察。

1.2.4免疫組化石蠟切片脫蠟水化，98℃檸檬酸抗原修復液5 min，冷卻至室溫。加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育12 min，動物非免疫血清封閉30 min，兔抗大鼠SCF抗體(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，生物素標記的羊抗兔的二抗，室溫作用30 min，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶30 min，DAB顯色，蘇木精復染后脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.5蛋白印跡提取各組大鼠小腸組織總蛋白，上樣量30 μg，電泳、轉膜、牛奶封閉，兔抗大鼠SCF(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜，HRP標記的二抗(1∶2 000稀釋)室溫作用1 h，暗室中曝光顯影定影。Quantity One軟件分析SCF灰度值與內參ACTB灰度值的比值代表定量值。

1.3統計學分析

2結果

2.1一般狀態和體質量

造模結束后，對照組大鼠狀態良好；燒傷模型組大鼠皮膚創面早期呈現蒼白色，一天后變暗逐漸轉為焦黑色，脫水后局部變硬可形成焦痂，有的可見栓塞血管，皮下組織間隙積液。模型組大鼠精神不佳，進水進食和活動減少。實驗初始體質量各組間無差異，對照組體質量逐漸上升，而燒傷組大鼠體質量增長緩慢，至燒傷后2天和4天燒傷組體質量顯著低于對照組(P<0.05)(見圖1)。

注：*P<0.05，與對照組比較

2.2病理組織學觀察

燒傷前組大鼠皮膚組織層次清晰，結構完整，燒傷組大鼠皮膚損傷累及全層，出現不同程度血管充血，角質層脫落，細胞壞死，炎性細胞浸潤(圖2)。證實嚴重燒傷模型造模成功。

燒傷前組小腸細胞形態正常，絨毛結構完整、排列整齊；燒傷模型組大鼠腸組織有不同程度損傷表現，間質和固有層水腫，絨毛頂端囊狀間隙甚至脫落，上皮細胞變性壞死。2天損傷表現最為嚴重，4天有所改善(見圖3)。

2.3免疫組化結果

燒傷后一天時SCF表達量與燒傷前相比減少，第二天后表達量有些回升，且各組間比較差異顯著(P<0.05)(見圖4)。

2.4Western blot結果

與燒傷前比較，SCF蛋白在燒傷后1天組大鼠腸組織中表達量有所下降，2天組和4天組明顯增高，差異顯著(P<0.05)(見圖5)。

A燒傷前組 B 燒傷1天組 C燒傷2天組 D燒傷4天組

A燒傷前組 B 燒傷1天組 C燒傷2天組 D燒傷4天組

A燒傷前組 B 燒傷1天組 C燒傷2天組 D燒傷4天組

注：*P<0.05，與燒傷前組比較；#P<0.05，與燒傷后1天組比較

3討論

燒傷模型組大鼠皮膚蒼白，碰觸沒有疼痛反射，轉而變暗變硬形成焦痂，有的可見樹枝狀血管栓塞，HE結果顯示燒傷累及大鼠皮膚組織全層，結合燒傷范圍基本可以確定嚴重燒傷造模成功。腸組織HE染色可見于燒傷后1天大鼠小腸組織絨毛上皮細胞變性壞死，排列紊亂，絨毛頂端出現囊狀間隙甚至脫落，間質和固有層水腫。2天損傷表現最為嚴重，4天有所改善。腸組織在嚴重燒傷時可有明顯病理損傷。小腸粘膜細胞生長快，4天即可以完成一次自我更新?？紤]為燒傷后部分尚有功能干細胞更替受損上皮細胞[9]，故燒傷后4天可見有一些好轉。

干細胞因子是一種酸性糖蛋白，是骨髓基質細胞在骨髓微環境中所產生的。有研究發現干細胞因子可以改變骨髓間充質干細胞(BMSCs)的微管結構[10]，促進BMSCs定位到損傷的心肌和肝臟組織并分化成具有功能細胞在損傷局部發揮修復作用[11,12]。此外可以調控胃腸道Cajal間質細胞生長發育、繁殖、功能以及維持腸道免疫[2,3]。

我們的研究結果顯示相對于燒傷前，燒傷后1天SCF蛋白表達有所降低，2天開始回升，4天基本恢復至損傷前的狀態。以往的研究曾報道燒傷可以導致大鼠腸系膜微動脈血管管徑減小，血液流速降低、流量減少[13]1天后逐漸回升[14]。大鼠腸在燒傷應激時結腸組織干細胞因子SCF的編碼基因Kitl在損傷后表達降低，2天后開始有所回升[15]。我們的實驗結果與上述研究時間規律基本吻合?？赡転闊齻竽c組織損傷促使骨髓干細胞動員，血液干細胞因子增多，而短期腸組織循環血量減少導致短暫低值。之后血運逐漸恢復，干細胞因子隨之到達受損組織，此外干細胞因子可以進一步刺激干細胞動員至損傷部分[16]致使局部組織干細胞因子編碼基因表達增高。

干細胞因子在燒傷后小腸組織表達的增多具體是通過什么途徑完成，其對燒傷腸組織損傷是否具有修復作用和具體機制仍待進一步證實。

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基金項目：國家自然科學基金(81573067)； 吉林省科技廳科技發展計劃項目資助課題(20130413023GH)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(2015533)；吉林省衛生計生科研計劃項目(2014Z046)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0875-04

中圖分類號：R392

文獻標識碼：A

(收稿日期：2015-12-18)

Expression of stem cell factor in the intesines in the severely burned rats

WANGYong-jie1,YANJun1,LILei1,etal.

(1.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofOrthopedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the small intestinal injury and stem cell factor expression of the damaged intestinal tissues in rats at different time after severe burn.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into 5 groups:group before burn,severe burn models on day 1,day 2,day 4,and control group,6 rats in each group.Severe burn models were prepared,rats body weights were recorded and general status were observed daily.Histopathological changes of small intestines of rats were observed by HE staining,detection of SCF expression was carried out by immunohistochemistry and Western blot.ResultsRats body weights increased gradually in the control group,body weights of model groups on the second and fourth days after severe burn were significantly lower than that in the control group (P<0.05).HE staining results showed that small intestines in the group before burn arranged neatly,cells presented normal morphology;in burn model groups,rats had varying degrees of burn injury,such as interstitial and propria edema,and epithelial cells degeneration and necrosis the top of villus fallen off.Pathological changes were most serious on the second day.Immunohistochemistry and Western blot results both showed SCF expression significantly reduced 1 day after burn compared with group before burn(P<0.05),rallied notablely on day 2 and day 4.ConclusionSevere burn can lead to intestinal injury of rats,SCF plays a role in burn-induced intestinal injury of rats.

Key words:burn;intestinal injury;stem cell factor