支氣管哮喘患者Th17和Th9細胞及其細胞因子的表達及臨床意義

李　志，楊婷婷，李文哲，王　波，薛邦祿

(1.大連市中心醫院 檢驗科，遼寧 大連116033；2.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧 大連116044)

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支氣管哮喘患者Th17和Th9細胞及其細胞因子的表達及臨床意義

李志1，楊婷婷1，李文哲2，王波1，薛邦祿1

(1.大連市中心醫院 檢驗科，遼寧 大連116033；2.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧 大連116044)

摘要：目的測定支氣管哮喘(Bronchial asthma)患者體內輔助性T細胞(Th )17和Th9細胞及其細胞因子白細胞介素(Interleukin,IL)17和IL-9的水平，探討兩種細胞的表達與哮喘的發病機制之間的關系。方法采用流式細胞術(Flow CytoMetry，FCM)檢測患病組和對照組外周血中Th17和Th9細胞的比例；應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中IL-17和IL-9的的含量。測得數據采用SPSS19.0統計軟件進行分析。結果與對照組相比，哮喘組患者外周血中Th17 和Th9細胞表達比例及IL-17和IL-9的濃度顯著升高(P<0.05)。結論Th17和Th9細胞的變化可能在哮喘發病機制中發揮重要作用

關鍵詞：支氣管哮喘；輔助性T細胞17；輔助性T細胞9；IL-17；IL-9

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0949)

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、淋巴T細胞和肥大細胞等多種細胞參與的慢性氣道炎癥，而CD4+T淋巴細胞在哮喘氣道炎癥中扮演重要的角色。目前研究顯示T淋巴細胞亞型Th17和Th9細胞均被證實與哮喘的發病有一定的關系，本研究通過檢測哮喘患者外周血Th17、Th9細胞與其相關細胞因子IL-17和IL-9等的表達水平，探討Th17與Th9細胞在哮喘發病中的意義。

1材料與方法

1.1標本采集

選取患者組為2013年11月至2014年5月本院門診和入院就醫的哮喘患者32例，哮喘的診斷符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制訂的《 支氣管哮喘防治指南》 的診斷標準[1]，其中男18例，女14例，年齡21-55歲，平均(33.2±10.4)且一個月內未使用糖皮質激素及其他免疫抑制劑。另選15例健康體檢者作為對照組，兩組在年齡、性別等一般臨床資料方面無顯著性差異(P>0.05)。

1.2主要試劑

異硫氰酸熒光素標記-抗人CD4單克隆抗體(FITC-CD4)、固定破膜劑IntraPrepTM購自美國Beckman公司；藻紅蛋白標記-抗人IL-17單克隆抗體(PE-IL-17)、PE-IL-9及同型對照購自美國eBioscience公司；刺激劑PMA、離子霉素Ionomycin、莫能霉素monensin購自美國Sigma公司；IL-17 、IL-9的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.3標本采集和處理

受檢者清晨空腹采血于肝素抗凝管中，其中一份密度梯度離心法分離外周血單核細胞(PBMCs)；另一份離心保留血清用于ELISA試驗檢測細胞因子。

1.4實驗方法

1.4.1Th17細胞和Th9細胞的流式檢測

用PBS溶液重懸分離好的外周血單核細胞，調整細胞濃度至1-2×106cells/ml，加入熒光素標記-CD4單抗，避光孵育20min，PBS洗滌后加入RPM1640培養體系(含刺激劑PMA50ng/ml、離子霉素1μg/ml、牛血清等)，放入37°溫箱孵育18-20小時。孵育后的細胞進行固定破膜(按照說明書進行操作)，PBS洗滌后將細胞平均分成四份，分別加入PE-IL-17單抗、PE-IL-9單抗及同型對照，避光孵育30min，洗滌后應用流式細胞儀測定標記細胞的熒光強度。

1.4.2ELISA檢測血清中IL-17和IL-9的含量

對于IL-17和IL-9的測定要嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5數據處理

用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據以“均數±標準差”表示，兩組間數據用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1支氣管哮喘患者外周血Th17和Th9細胞的表達

與對照組相比，哮喘組患者外周血中Th17 和Th9細胞表達比例顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　　　　哮喘組與對照組患者外周血中Th17、Th9細胞

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2支氣管哮喘患者外周血IL-17、IL-9的表達水平

與對照組相比，哮喘組患者血清中IL-17和IL-9的濃度顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　哮喘組與對照組血清中IL-17和IL-9的濃度

注：與對照組相比，*P<0.05

3討論

支氣管哮喘是一種病因尚未明確的氣道慢性炎癥，由多種致炎細胞參與如嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等，而CD4+T淋巴細胞在哮喘氣道炎癥中發揮重要的作用。

傳統認為Th1/Th2細胞及細胞因子(IL-9)在哮喘的發病機制中起著重要的致病作用，Douwes[2]等發現約有一半的哮喘患者并未表現出Th2途徑的應答特征，而且嗜酸粒細胞也沒有明顯升高，而另一半的哮喘患者的肺組織則以中性粒細胞浸潤為主，因此認為IL-17具有強大的募集中性粒細胞的功能，其在哮喘發病中的作用也被廣泛研究。然而，有學者提出Th17細胞本身并不能引起嗜酸性粒細胞性氣道炎癥，但卻能增強Th2細胞介導的嗜酸性氣道炎癥[3]。本實驗證實哮喘患者體內的Th17細胞及其細胞因子IL-17的分泌顯著升高，與劉[4]等的研究結果相一致。Zhao等研究證實重癥哮喘患者體內Th17細胞的表達及細胞因子IL-17、IL-22的水平顯著的高于輕度和中度患者，說明Th17的水平和功能與哮喘的嚴重程度成正相關[5]，尤其是急性或重度哮喘患者的急性發作期和嚴重的氣喘患者。

有學者指出Th17細胞分泌的IL-17可通過直接誘導IL-8的產生或者間接誘導粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和CXC趨化因子配體8(CXCL-8)來募集和活化中性粒細胞[6]。也有學者認為IL-17與受體結合后,主要通過活化MAP激酶,激活NF-κB的活性從而發揮IL-17的生物學活性，IL-17能作用于氣道上皮、肺成纖維細胞和其他的炎癥細胞從而引起促炎細胞因子、化學介質和金屬基質蛋白酶的產生進而導致中性粒細胞及巨噬細胞的表達，進而引發組織炎癥[7]。

過去人們一直認為IL-9屬于Th2類細胞因子,可作用于多種炎癥細胞和組織細胞,在哮喘中發揮著重要的作用[8]，直到以IL-9為主要分泌因子的Th9細胞被發現，Th9細胞及IL-9在哮喘發病中的作用才被廣泛研究。哮喘患者支氣管活檢發現IL-9mRNA明顯增高[9],在哮喘患者接觸過敏原后，其肺泡灌洗液BAL中IL-9及IL-9mRNA的水平較正常對照組明顯增加[10]。實驗證實將Th9和Th2細胞分別過繼到Rag2-/-小鼠體內，發現兩者均可導致小鼠的哮喘癥狀的發生，但是Th9引發的哮喘比Th2的癥狀更嚴重，說明Th9細胞能夠引發氣道高反應性，嗜酸粒細胞增多，粘液分泌增多等[8,11]。動物實驗證實，IL-4能介導B細胞分化產生IgE，而IL-9能夠促進此過程，且IL-9能夠促發T細胞和肥大細胞的增殖，進而加重過敏炎癥反應[12]；不僅如此，IL-9可以促進嗜酸性粒細胞的成熟、嗜酸性粒細胞趨化因子的表達及支氣管上皮細胞T細胞的分化成熟。此外，IL-9還可以作用于平滑肌細胞和氣道上皮細胞等組織細胞,促進分泌促炎因子并出現大量的杯狀細胞,分泌大量的黏液,在氣道高反應性的發生發展中起了一定的作用[13]。

各種免疫細胞在微環境中能發揮著各自的功能維持免疫穩態，Th17與Th9細胞既相互共生又相互抑制，并且與其分泌的細胞因子在哮喘疾病病程中發揮重要作用。但是兩種細胞之間存在怎么樣的聯系與哮喘的發生究竟有怎樣的關系還需要進一步的研究。

參考文獻：

[1]中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義，診斷，治療管理方案)[J].中華結核和呼吸雜志,2008,31(3):177.

[2]DouwesJ,GibsonP,PekkanenJ,etal.Non-eosinophilicasthma:importanceandpossiblemechanisms[J].Thorax,2002,57(7):643-648.

[3]HiroshiN,KoichiH.RoleofIL-23andTh17CellsinAirwayInflammationinAsthma[J].ImmuneNetwork,2010,10(1):1.

[4]劉澤宇,夏書月,王冉.哮喘患者外周血Th17細胞水平及功能的研究[J].重慶醫學，2013，42(31):3766.

[5]YangZhao,JiongYang,Ya-dongGao,etal.Th17ImmunityinPatientswithAllergicAsthma[J].IntArchAllergyImmunol,2010,151(4):297.

[6]CosmiL,LiottaF,MaggiE,etal.Th17cells:newplayersinasthmapathogenesis[J].Allergy,2011,66(8):989.

[7]VanHamburgJP,AsmawidjajaPS,DavelaarN,etal.Th17cells,butnotTh1cells,frompatientswithearlyrheumatoidarthritisarepotentinducersofmatrixmetalloproteinasesandproinflammatorycytokinesuponsynovialfibroblastinteraction,includingautocrineinterleukin-17Aproduction[J].ArthritisRheum,2011,63(1):73.

[8]李志,楊婷婷,徐維家.Th17和Th9細胞與支氣管哮喘病理機制研究的新進展[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(12):1553.

[9]VockC,HauberHP,WegmannM.TheotherThelpercellsinasthmapathogenesis[J].Allergy,2010,doi:10.1155/2010/519298.

[10]YingS,MengQ,KayAB,etal.Elevatedexpressionofinterleukin- 9mRNAinthebronchialmucosaofatopicasthmaticsandallergen-inducedcutaneouslate-phasereaction:relationshipstoeosinophils,mastcellsandTlymphocytes[J].ClinExpAllergy,2002,32(6):866.

[11]StaudtV,BothurE,KleinM,etal.Interferonregulatoryfactor4isessentialforthedevelopmentalprogramofThelper9cells[J].Immunity,2010,33(2):192-202.

[12]XingJC,WuYZ,NiB.Th9:ANewPlayerinAsthmaPathogenesis[J].JournalofAsthma,2011,48(2):115.

[13]田潔,王勝軍,許化溪.Th9細胞:一種新型效應性CD4+T細胞亞群[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25(9):853.

基金項目：大連市醫藥衛生科學研究項目(2012)

文章編號：1007-4287(2016)06-0949-03

中圖分類號：R562.5

文獻標識碼：A

作者簡介：李志(1971-)，男，碩士，主任技師，主要從事自身免疫及分子生物學研究。

(收稿日期：2014-11-28)

ResearchonthepopulationofTh17andTh9cellsandtheexpressionofthecytokinesinbronchialasthmapatients

LI Zhi1,YANG Ting-ting1,LI Wen-zhe2,et al.

(1.Department 0f Clinical Laboratory,Dalian Municipal Central Hospital,Dalian 116033,China;2.School of Basic Medical Sciences,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

Abstract:ObjectiveTo examine the proportion of peripheral of T helper cell 17(Thl7) and Th9 cells and the levels of interleukin 17(IL-17),IL-9 in bronchial asthma patients,and to discuss the role of Th17 and Th9 cells in the pathogenesis of asthma.MethodsFlow cytometric assay was used to analyse the percentages of Th17 and Th9 cells in patients and normal controls.The levels of IL-17 and IL-9 in plasma were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Measured data were analyzed by using the statistical software SPSS19.0.ResultsThe percentages of Th17,Th9 cells and levels of IL-17,IL-9 in patients with asthma were significantly higher than that of normal controls(P<0.05).ConclusionTh17 and Th9 cells may play an important role in the pathogenesis of asthma.

Key words:Bronchial asthma;T helper 17;T helper 9;Interleukin 17;Interleukin 9