實時熒光定量PCR檢測血清miR-7方法的建立及臨床初步應用

陳　鑫，韓　霜，臧素綱，楊萍燦，汪曉鶯，周玉貴*

(1.南通大學附屬東臺醫院 檢驗科,江蘇 東臺224200;2.南通大學醫學院 免疫教研室，江蘇 南通226001)

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實時熒光定量PCR檢測血清miR-7方法的建立及臨床初步應用

陳鑫1，韓霜1，臧素綱1，楊萍燦1，汪曉鶯2，周玉貴1*

(1.南通大學附屬東臺醫院 檢驗科,江蘇 東臺224200;2.南通大學醫學院 免疫教研室，江蘇 南通226001)

摘要：目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I 實時熒光定量PCR方法檢測血清miR-7，并作臨床初步應用。方法用Trizol試劑提取血清總RNA。miR-7 ploy(A)聚合酶加尾逆轉錄獲得cDNA，進行SYBR Green I實時定量PCR擴增檢測。制作C.elegans-miR-39模擬物濃度梯度稀釋的標準曲線，絕對定量血清中miR-7的表達水平。結果該方法能定量檢測血清miR-7表達水平，熔解曲線呈單峰，PCR擴增產物特異，在103copies/uL至106copies/uL范圍內有良好的線性關系(r2=0.995)，并且檢測重復性好。糖尿病患者血清中miR-7表達水平明顯高于健康體檢者(P<0.05)。結論所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I 實時熒光定量PCR方法能敏感、特異地檢測血清中miR-7的表達水平，為下一步臨床應用的研究奠定了方法學基礎。

關鍵詞：SYBR Green I實時熒光定量PCR；miR-7；糖尿病

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0959)

microRNAs(miRNAs)是近年來研究發現的一類分布廣泛的小分子RNA。它們基于與靶mRNA的序列互補配對結合，可以降解靶mRNA或抑制蛋白質翻譯。作為一種新型基因表達調控因子，miRNAs參與生命過程中一系列的重要生物學進程，包括個體發育、器官形成、干細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡等[1-3]。隨著研究的不斷深入，miRNAs與疾病之間的關系也趨于明朗化，已成為目前臨床應用研究的熱點內容。有報道表明，miR-7是胰島組織內表達最豐富的內分泌miRNA[4]，參與胰島的發育和胰島素合成，提示其在糖尿病的發病機制中可能扮演重要角色。因此，血清miR-7表達水平的檢測是其臨床應用研究首當其沖需解決的問題。

據此，本研究建立了ploy(A)聚合酶加尾的SYBRGreenI實時熒光定量PCR的檢測方法。應用此種方法檢測血清標本中miR-7的表達水平，初步探索是否能將miR-7作為糖尿病診斷的新型生物學標志物。

1材料與方法

1.1研究對象收集2012年6月至2013年6月南通大學附屬東臺醫院糖尿病患者118例，其中男59例，女59例，年齡26-88歲，均經WHO(1999年)糖尿病診斷標準確診，病程數月到數年不等。同期健康體檢者106例作為對照組，其中男52例，女54例，年齡28-84歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2樣本采集所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血3-5ml。分離血清后分裝至-80℃恒溫冰箱保存。

1.3主要試劑與儀器Trizol溶解試劑、dNTP混合物、逆轉錄酶、逆轉錄緩沖液、TaqDNA聚合酶、內含SYBRGreenI熒光染料的PCR緩沖液、焦炭酸二乙酯(DEPC)、TAE緩沖液、溴化乙錠(EB)、離心管(南通碧云天技術研究所)，無水乙醇、氯仿、異丙醇(無錫展望化工試劑有限公司)，100bpDNALadderMarker(大連寶生物工程有限公司)。RotorGeneQ實時熒光定量PCR分析儀(德國QIAGEN公司)、HC-2518R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)、SMA1000微量紫外分光光度計(北京美林恒通公司)、DYY-III8A型穩壓穩流定時電泳儀(北京六一儀器廠)、DH-2000凝膠成像系統(北京華電公司)、BSC-1500ⅡA2X型生物安全柜(濟南鑫貝西生物技術有限公司)。

1.4引物設計和合成根據miRBASE(http://www.mirbase.org/)數據庫中hsa-miR-7(UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU)的序列，設計其特異性poly(A)加尾逆轉錄引物和PCR擴增引物。線蟲C.elegans-miR-39的模擬物、內參hsa-miR-15a及其引物均由德國QIAGEN公司設計合成(公司未予公開)。

1.5血清總RNA提取取200μL復溶的血清于離心管中，加入Trizol溶解試劑，充分混勻裂解；之后分別用氯仿、異丙醇及DEPC水配制的乙醇，并結合硅膠膜特異性吸附作用來分離和純化RNA。RNA從離心管硅膠膜上洗脫溶于DEPC水中。通過測定計算RNA溶液260nm和280nm的紫外吸收值的比值(A260/A280)確認RNA濃度和純度。

1.6逆轉錄反應反應體系體積為20μL，包括總RNA樣本、dNTP混合物、逆轉錄酶、逆轉錄緩沖液、DEPC水。逆轉錄反應參數：37℃60min，95℃5min。逆轉錄反應獲得的cDNA于-80 ℃保存。

1.7實時熒光定量PCR反應體系體積為20μL，包括miRNA逆轉錄產物cDNA、dNTP混合物、miR-7上游特異引物、下游通用引物、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液(內含SYBRGreenI熒光染料)、DEPC水。PCR反應循環參數：95℃預變性15min；94℃變性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，共40個循環。以同樣的反應體系和hsa-miR-15a特異性引物進行內參hsa-miR-15a熒光定量。以DEPC水代替逆轉錄產物cDNA作為陰性對照。

1.8標準曲線的制作將人工合成的C.elegans-miR-39的miRNA模擬物以DEPC水稀釋8個數量級，即101、102、103、104、105、106、107以及108copies/μL，分別取每一數量級稀釋液2μl與待測標本同時進行逆轉錄以及PCR擴增檢測，每反應設置3個復孔。擴增后根據擴增曲線設定統一閾值，然后根據標準品的濃度及每個濃度對應的CT平均值繪制標準曲線。根據此標準曲線及待測樣本的CT值計算出該血清標本miR-7的絕對濃度，為絕對定量法。

1.9PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳配制2%的瓊脂糖凝膠，加入溴化乙錠(EB)溶液至終濃度0.5μg/mL，80V恒壓電泳40min，待溴酚藍跑到2/3位置處停止電泳，紫外燈下觀察產物的有無及大小。

2結果

2.1血清總RNA抽提及純度檢測的結果

經測量計算，所有標本提取RNA溶液的A260/A280比值(1.916±0.089)均在1.8-2.1范圍內，表明RNA純度較好，可以用于后續的實驗。

2.2熔解曲線及PCR擴增產物電泳驗證

如圖1所示，熔解曲線呈單峰，未見雜峰信號，熔解溫度約為77℃。表明逆轉錄PCR參數選擇適當，產物特異性較好。poly(A)聚合酶加尾法逆轉錄PCR反應獲得的PCR擴增產物的大小應約為85bp-87bp。PCR擴增產物經2%瓊脂糖電泳，可見明亮、清晰的電泳條帶，與預期大小一致，如圖2所示。

2.3熒光定量PCR法的檢測重復性試驗

任取1份糖尿病患者血清標本的RNA抽提溶液，在1次熒光定量PCR中設置10個平行孔進行檢測，計算批內變異系數(CV)。結果顯示：miR-7的拷貝數為(111.49±3.99)×103copies/uL，批內CV為3.58%。對同1份標本進行連續10次熒光定量PCR的檢測，計算批間變異系數(CV)。結果顯示：miR-7的拷貝數為(107.94±5.71)×103copies/uL，批間CV為5.29%。

圖1　實時熒光定量PCR熔解曲線

圖2　逆轉錄PCR擴增產物的電泳圖

2.4檢測miR-7時標準品的擴增曲線及標準曲線

如圖3所示，檢測標準品C.elegans-miR-39模擬物的擴增曲線呈S型。在103copies/uL至106copies/uL的范圍內CT值和標準品濃度呈良好線性關系，r2為0.995，制作成標準曲線如圖4。

圖3　103至106copies/uL4個濃度梯度標準品的擴增曲線

2.5miR-7在糖尿病患者及健康體檢者血清中檢測結果的比較

118例糖尿病患者和106例健康體檢者的血清標本均可見擴增曲線，但表達程度不同，見圖5。由表1可見，糖尿病患者和健康體檢者血清中miR-7的表達水平分別為(21.01±12.90)×103copies/uL和(2.65±1.18)×103copies/uL，糖尿病患者血清miR-7的表達水平高于健康體檢者。經Mann-whitneyU檢驗進行組間比較，兩組之間的差異具有統計學意義(P=0.015)。

圖4　檢測標準曲線

圖5　　　　部分糖尿病患者及健康體檢者血清中miR-7熒光定量PCR擴增曲線

組別n平均Ct值平均拷貝數(103copies/uL)糖尿病患者11826.81±3.6221.01±12.90健康體檢者10630.01±2.762.65±1.18

3討論

miRNAs轉錄后的調節功能與多種疾病的病理生理過程有關，包括糖尿病。2008年，Bravo-Egana等人[4]通過對比miR-375在胰島和腺泡組織的不同表達情況后，得出結論：miR-7是胰島內表達最豐富的內分泌miRNAs。隨后，miR-7參與調控胰島β細胞分化發育，與血糖平衡調節有關的研究陸續被報道[5,6]。因此，miR-7有成為診斷糖尿病的新生物學標志物的潛質。

要將miRNAs作為疾病診斷的生物學標志物，需要建立標準且規范的提取方法和檢測方法。近年來，miRNAs的檢測技術得到了快速發展。對于新發現的miRNAs，克隆測序是首選的鑒定方法[7]。Northernblot是驗證和確認miRNAs的經典方法，常用來評價其它的miRNAs檢測方法的可靠性，但該方法繁瑣且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測[8]?；蛐酒夹g可以實現快速、高通量檢測[9]，但結果重復性差、準確度低，常用作初篩。而實時熒光定量PCR靈敏度高、特異性好、操作流程簡單、設備和試劑要求相對較低，因此便于普通臨床實驗室開展。

本研究采用poly(A)聚合酶加尾逆轉錄和SYBRGreenI熒光染料標記技術，建立了一種實時熒光定量PCR法檢測血清中miR-7的表達水平。熔解曲線呈特異性單峰，擴增曲線呈典型S型，無引物二聚體和非特異性擴增產物的形成。PCR反應擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，也可見明亮、清晰的條帶，且與預期大小基本一致，證明擴增產物的特異性較好。以人工合成的C.elegans-miR-39miRNA模擬物繪制標準曲線，為絕對定量法，這與目前實時熒光定量PCR使用較多的相對定量法[10,11]不同。標準品CT值與其濃度在103copies/uL至106copies/uL的范圍內呈良好線性關系(r2=0.995)，反映該方法能準確地定量檢測血清中miR-7的表達水平。通過批內和批間重復性實驗分析可見：批內CV為3.58%，批間CV為5.29%，表明該檢測方法具有較好的重復性。由此可見，所建立的檢測方法可用于臨床上檢測血清中miR-7的表達水平。通過分析定量檢測數據，我們發現：118例糖尿病患者血清中miR-7的表達水平明顯高于106例健康體檢者(P=0.015)，這一結果與之前的文獻報道[5,6]吻合。

綜上所述，本研究建立的ploy(A)聚合酶加尾的SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測血清miR-7是一種簡便、靈敏度高、特異性強和穩定性好的方法，適合臨床實驗室廣泛開展，為miR-7在糖尿病中臨床應用價值的深入研究打下了基礎。

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基金項目：江蘇省鹽城市醫學科技發展計劃項目(YK20130103)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0959-04

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

作者簡介：陳鑫，31歲，碩士，主管檢驗技師，主要從事免疫學及分子生物學方面的研究。

(收稿日期：2014-09-17)

Establishmentofareal-timefluorescencequantitativePCRmethodfordetectingmiR-7inserumanditsclinicalprimaryapplication

CHEN Xin,HAN Shuang,ZANG Su-gang,et al.

(Department of Clinical Laboratory,Dong-tai Hospital Affiliated Nantong University,Jiangsu Dongtai 224200,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method of SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)by poly(A)polymerase tailing for the determination of miR-7 in serum,and apply it primarily.MethodsTotal RNA was extracted from serum by Trizol reagent.miR-7 was reverse transcripted into cDNA by tailing poly(A)polymerase,and then the cDNA was amplified and detected by using SYBR Green I real-time FQ-PCR.Generate a standard curve of a dilution series of C.elegans-miR-39 mimic,and detect the expression level of miR-7 in serum quantitatively.ResultsThe method can quantitatively detect the expression level of miR-7 in serum.The melting curve showed a single peak,the PCR products was specific,a good linear relationship in the range of 103copies/uL to 106copies/uL (r2=0.995),and the detection was repeatable.The expression level of miR-7 in diabetic patients was significantly higher than those in healthy subjects (P<0.05).ConclusionThe method of SYBR Green I FQ-PCR by poly(A)polymerase tailing can detect the expression level of miR-7 sensitively and specifically in serum.It lays a methodological foundation for further study on clinical application.

Key words:SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR；miR-7；diabetes mellitus