Nisin復合微粒的制備及其抗菌穩定性的研究

王卉，邵東旭，何節玉，孫宏元（瓊州學院食品科學與工程系，海南三亞572022）

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Nisin復合微粒的制備及其抗菌穩定性的研究

王卉，邵東旭，何節玉，孫宏元
（瓊州學院食品科學與工程系，海南三亞572022）

摘要：乳酸鏈球菌素（Nisin）在應用中生物活性受到許多化學和物理因素的影響，采用殼聚糖（CS）/果膠（PE）復合凝聚物對Nisin進行包埋，研究反應的條件及復合微粒的形態結構，并考察包封Nisin經高溫和胰蛋白酶處理后的抗菌穩定性。試驗結果表明：在pH6、CS/PE質量比0.6、Nisin濃度1.5%時，Nisin包封率為87.3%，果膠的羧酸和殼聚糖的氨基通過靜電相互作用，包封Nisin的顆?；境汕蛐?，大小約在100 nm～800 nm之間。經120℃處理20 min后，包封Nisin抗菌率是游離Nisin的4倍。當胰蛋白酶與Nisin反應10 min后，游離的Nisin抗菌率只有5%，而包封Nisin抗菌率仍有73%，反應60min后，抗菌率還有29%，說明CS/PE壁材對Nisin的抗菌性起到很大的保護作用。

關鍵詞：乳酸鏈球菌素；果膠；殼聚糖；抗菌穩定性

乳酸鏈球菌素（Nisin）對大部分革蘭氏陽性細菌和芽孢的生長和繁殖有抑制作用，是公認的高效、無毒的天然食品防腐劑，能有效延長產品貨架期，因此受到越來越多的重視［1］。但Nisin在應用中存在穩定性差，生物活性受到許多化學和物理因素的影響，如溫度、pH值和鹽等，并能與食品中的蛋白質、脂肪、酶等組分發生反應［2-3］，導致Nisin抑菌能力降低。Nisin被用于鮮肉防腐，會受到肉中蛋白酶的分解，需增加添加量才能達到保鮮效果［4］。包埋技術能有效地解決Nisin穩定性的問題，包封壁材能降低食品生產加工過程中不同環境對Nisin的破壞，保證Nisin抑菌性能。主要的包封材料有脂質體［5］，海藻酸鈉［6］、聚乳酸［7］和殼聚糖［8］等。

基于靜電相互作用的聚電解質復合反應是發生在兩種或兩種以上大分子之間的的自聚集現象，若體系中同時存有被包埋的芯材物質，可形成包埋微粒［9］。其包埋方面的特性能保護和控制釋放有效成分，提高產品品質，被廣泛應用于農業、生物技術、食品調味品、生物醫藥、化妝品以及紡織品等領域［10］。目前使用的天然聚陽離子主要有殼聚糖（CS）、多肽等，聚陰離子主要是天然多糖，如海藻酸鈉、阿拉伯膠、果膠、聚陰離子纖維素、硫酸葡聚糖等。

本論文利用殼聚糖為聚陽離子，低酯果膠為聚陰離子制備包封Nisin的復合微粒，考察反應條件對形成復合物的影響，研究包封Nisin的抗菌穩定性。

1　材料與方法

1.1材料與設備

殼聚糖（脫乙酰度≥95%）：廣東省齊云生物技術有限公司；低酯果膠（酯化度30%～40%）：浙江衢州果膠有限公司；乳酸鏈球菌肽（食品級）：浙江新銀象生物工程有限公司；胰蛋白酶（食品級，活力10 000 IU/g）：鄭州鴻祥化工有限公司；其他試劑均為分析純。

UV2550紫外可見分光光度計、IRAffinity-1傅立葉變換紅外光譜儀：日本島津；PHS-2C酸度計：金壇市盛藍儀器制造有限公司；HitachiH-600透射電子顯微鏡：日本日立公司。

1.2方法

1.2.1CS/PE最佳質量比的測定

配制濃度為1 mg/mL果膠的水溶液，濃度1 mg/mL的殼聚糖溶液用0.5%的醋酸配制，在20℃下，邊攪拌邊將殼聚糖溶液逐滴加入果膠溶液中，于500 nm處測定溶液吸光度隨果膠滴加量的變化，該波長下殼聚糖和果膠均沒有吸收，確定最佳CS/PE的質量比。

1.2.2pH對形成CS/PE復合物的影響

分別調節果膠水溶液（5 mg/mL）與殼聚糖醋酸溶液（5 mg/mL）的pH為2、3、4、5、6、7，按最佳質量比將殼聚糖加入到果膠溶液，反應10 min，將復凝聚產物超速離心，過濾沉淀，干燥，計算復凝聚反應的產率，以反應產率為評價指標找出最佳的反應pH值。

1.2.3Nisin/CS/PE復合微粒的制備和測定

1.2.3.1Nisin/CS/PE復合微粒的制備

分別調節果膠水溶液（5 mg/mL）與殼聚糖醋酸溶液（5 mg/mL）至最佳反應pH值，在殼聚糖溶液中加入吐溫80（殼聚糖添加量的5%）和Nisin（Nisin的濃度為0.5%、1.0%、2.0%），攪拌均勻，制備Nisin乳液。將Nisin乳液和果膠溶液同時滴加到攪拌的蒸餾水中，滴加完成后繼續反應10 min，所得Nisin/CS/PE分散液置于4℃下待用。

1.2.3.2Nisin包埋率的測定

將Nisin/CS/PE分散液離心分離，取上清液，采用考馬斯亮藍法［11］檢測上清液中Nisin的量來計算包封率。

1.2.3.3紅外光譜測定

將樣品置于紅外干燥箱中除水干燥后，與KBr混勻研磨成粉狀，壓片，用IRAffinity-1傅立葉變換紅外光譜儀測定，以空白KBr為背景于400 cm-1～4 000 cm-1間掃描。掃描次數為30次，分辨率為4 cm-1。

1.2.3.4電子透射電鏡

將少量Nisin/CS/PE分散液直接滴在銅網上，待水分基本揮發干凈后，磷鎢酸染色。用濾紙吸走多余的染體，自然干燥，用透射電子顯微鏡（HitachiH-600）觀察納米粒子的形態和大小。

1.2.4溫度對Nisin抗菌能力的影響

配制濃度250 μg/mL、pH 6的Nisin水溶液，用水稀釋Nisin/CS/PE分散液使Nisin濃度為250 μg/mL，將Nisin水溶液和包封Nisin的分散液分別在不同溫度（60、90、120℃）下保持20 min，測定抗菌率。

1.2.5胰蛋白酶對Nisin抗菌能力的影響

在Nisin水溶液和包封Nisin的分散液（濃度為250 μg/mL，pH 6）中加入20 μg/mL的胰蛋白酶，于37℃，200 r/min搖床振蕩10、30、60、90 min，反應結束后在100℃滅酶10 min，測定抗菌率。

1.2.6Nisin抗菌率測定

制備營養瓊脂培養基平板，在10mL適宜菌含量的金黃色葡萄球菌菌液中，分別加入0.2mL處理的Nisin水溶液和包封Nisin的分散液（濃度為250 μg/mL，pH 6），混合均勻后，取出0.2 mL涂布于平板上培養，各制備3個平板，37℃培養18 h～24 h。觀察并記錄各平板的菌落個數，取平均值。

2　結果與討論

2.1CS/PE最佳質量比的測定

溶液吸光度與CS/PE質量比的關系如圖1所示。

圖1　CS/PE質量比對溶液吸光度的影響Fig.1　Effect of CS/PE ratio on absorbance of solution

兩種聚電解質在溶液中發生復凝聚反應時，形成復合物分散液，其吸光度升高，因此可根據溶液吸光度的變化來確定復合反應的進行程度。當CS/PE的質量比在0～0.6之間變化時，隨著殼聚糖含量增加，吸光度上升，這是由于果膠分子鏈上的帶負電的羧基與殼聚糖帶正電的氨基基團相互作用，生成疏水性的聚電解質復合物，0.6是這個曲線變化的拐點也是曲線最高點，表明溶液中所含的離子量最少，反應最充分，是最佳的質量比。當超過0.6后，由于溶液被稀釋，吸光度逐漸降低。

2.2pH值對復合過程的影響

當CS/PE質量比為0.6時，復合產率隨pH值的變化如表1所示。

表1　pH值對CS/PE復合物產率的影響Table 1　Effect of pH on the yield of CS/PE complex

由表1可知，pH為5～6時，凝聚產率最高，達92.1%，說明殼聚糖中氨基和果膠上羧酸之間的靜電作用最強。當pH值降低時，由于果膠中羧酸離解程度變弱，電荷密度降低，產率逐漸降低，當pH值增大呈堿性時，殼聚糖中氨基不能被質子化，與果膠不能形成復合粒子。

2.3CS/PE和Nisin/CS/PE復合物的紅外光譜分析

圖2為殼聚糖、果膠和CS/PE的紅外光譜圖，圖3 為CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE的紅外光譜圖。

圖2　CS、PE和CS/PE的紅外光譜圖Fig.2　FTIR of CS、PE、CS/PE

由圖2可見，殼聚糖在1 647 cm-1附近的吸收峰是氨基N-H鍵的彎曲振動，果膠在1 745 cm-1處的吸收峰為半乳糖醛酸羧基形成的酯鍵中羰基的伸縮振動；1 620 cm-1處的吸收峰為游離的羧酸中羰基的不對稱伸縮振動，在CS/PE中，殼聚糖氨基峰向低波數移動至1 640 cm-1，果膠中酯鍵羰基吸收峰減弱，1 628 cm-1處離子化的羧基峰消失，表明殼聚糖和果膠通過離子鍵進行反應。

圖3中Nisin的主要吸收峰1630cm-1和1539cm-1相應于Nisin中酰胺I和II鍵，在Nisin/CS/PE中也有出現，表明Nisin包裹在復合物中。

2.4Nisin濃度對復合物包封率的影響

不同Nisin濃度對包封率的影響見表2。

圖3　CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE的紅外光譜圖Fig.3　FTIR of CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE

表2　不同Nisin濃度對包封率的影響Table 2　The effect of Nisin concentration on encapsulated efficiency

由表2可知，在Nisin濃度為1.5%時，Nisin/CS/PE復合物中Nisin的包封率最高，達87.3%，在Nisin濃度很低的情況下，由于溶液中Nisin分子數少，增加了聚電解質在形成過程中對Nisin分子的“捕捉”難度，造成對目標物分子的包封率小。當Nisin濃度超過1.5%時，包封率又有所下降。

2.5Nisin/CS/PE復合物的形態

Nisin/CS/PE復合物的透射電鏡圖如圖4所示。

圖4　Nisin/CS/PE復合物的透射電鏡圖Fig.4　TEM image of Nisin/CS/PE complex

圖4為透射電鏡下觀察到的Nisin/CS/PE復合物的形態，由圖中可見，復合物顆粒的形狀基本成球形，大小不是很均一，顆粒之間無明顯團聚現象，表明體系較穩定，大小大約在100 nm～800 nm。

2.6溫度對Nisin抗菌能力的影響

溫度對Nisin抗菌能力的影響如圖5所示。

圖5　溫度對Nisin抗菌能力的影響Fig.5　Effect of temperature on the antibacterial activity of Nisin

由圖5可知，隨著處理的溫度升高，Nisin的抗菌率逐漸降低，經60℃處理20 min，包封Nisin和游離Nisin的抗菌性基本相同，溫度升高對包封Nisin的抗菌率影響不大，經120℃處理20 min，仍有65%，而游離Nisin的抗菌率顯著降低到15%。說明CS/PE壁材對Nisin的抗菌性起到很大的保護作用。

2.7胰蛋白酶對Nisin抗菌率的影響

胰蛋白酶對Nisin抗菌率的影響如圖6所示。

圖6　胰蛋白酶對Nisin抗菌率的影響Fig.6　Effect of trypsin on the antibacterial activity of Nisin

由圖6可知，當胰蛋白酶與Nisin反應10 min后，游離的Nisin抗菌率只有5%，而包封Nisin抗菌率仍有73%，隨著反應時間的延長，包封Nisin抗菌率逐漸降低，在60 min時，抗菌率剩下29%。由于Nisin是多肽，對蛋白酶很敏感，游離的Nisin與胰蛋白酶反應后很快失去抗菌性，而包封Nisin由于受到CS/PE壁材的保護，所以能保持一定的抗菌活性，但在反應60 min后，抗菌性也大大降低。

3　結論

帶負電荷果膠與帶正電荷殼聚糖在進行復合反應能對Nisin進行有效的包埋，提高了Nisin的抗菌穩定性，復合反應產率受反應條件的影響，在pH 6、CS/ PE質量比0.6、溶液中Nisin濃度1.5%時，生成的復合物對Nisin的包封率為87.3%，果膠的羧酸和殼聚糖的氨基通過靜電相互作用，包埋Nisin顆?；境汕蛐?，大小約在100 nm～800 nm之間。溫度和蛋白酶能降低Nisin的活性，包封的Nisin穩定性大于游離的Nisin，經高溫和胰蛋白酶的處理，游離Nisin的抗菌率損失很大，而包封Nisin仍具有較強的抗菌性。說明CS/PE壁材對Nisin的抗菌性起到很大的保護作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.003

基金項目：國家自然科學基金資助項目（51363018）

作者簡介：王卉（1968—），女（漢），教授，博士，研究方向：天然大分子和食品保鮮。

收稿日期：2015-05-13

Studies on Preparation of Nisin Complex Particles and Antibacterial Stability

WANG Hui，SHAO Dong-xu，HE Jie-yu，SUN Hong-yuan

（Department of Food Science and Technology，Qiongzhou University，Sanya 572022，Hainan，China）

Abstract：The biological activities of Nisin are affected by many chemical and physical factors.Nisin was encapsulated in the complex of chitosan（CS）and pectin（PE）.The reaction conditions，structure and morphology of the complex were studied.The antibacterial stabilities of encapsulated Nisin were measured after high temperature and trypsin treatment.The results showed that the encapsulation effect of Nisin was 87.3%in pH6 with 0.6 of the CS/PE ratio and 1.5%of Nisin concentration.Carboxyl groups on pectin and amino groups on chitosan react by electrostatic interactionsand particle sizesof Nisin/CS/PE complex range from 100 nm to 800 nm with spherical shape.The antibacterial rate of the encapsulated Nisin was four times that of free Nisin after treatment for 20 min at 120℃.After reaction with trypsin for 10 min，the antibacterial rate of free Nisin only left 5%，while that of encapsulated Nisin was 73%，and remained 29%after 60 min.The results demonstrated that wall material CS/PE had great protective effect on the antibacterial rate of encapsulated Nisin.

Key words：Nisin；pectin；chitosan；antibacterial stability