草蓯蓉多糖對HepG2細胞氧化應激的抑制作用

全吉淑，王玉嬌，尹基峰，高峰，尹學哲，*（.延邊大學醫學院，吉林延吉3300；.延邊大學附屬醫院，吉林延吉33000）

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草蓯蓉多糖對HepG2細胞氧化應激的抑制作用

全吉淑1，王玉嬌1，尹基峰2，高峰1，尹學哲2，*
（1.延邊大學醫學院，吉林延吉133002；2.延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000）

摘要：研究草蓯蓉多糖（BRPS）對過氧化氫（H2O2）所致HepG2細胞氧化應激的抑制作用。以HepG2細胞為研究對象，通過H2O2誘導細胞氧化應激損傷模型，采用四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測細胞存活率；比色法檢測培養液中乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）活性以及細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）水平；蛋白印跡法測定細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38）活化水平。結果表明，BRPS在質量濃度12.5 mg/L～50 mg/L范圍內對HepG2細胞存活率無顯著影響，對細胞安全。而H2O2誘導使HepG2細胞存活率和抗氧化能力下降，細胞內ERK和JNK磷酸化水平升高。與H2O2模型組相比，BRPS預處理可提高細胞存活率；降低培養液中LDH、AST和ALT活性；降低細胞內MDA含量，升高細胞中SOD活性和GSH含量，降低細胞內ERK和JNK磷酸化水平。提示，BRPS對H2O2所致HepG2細胞氧化應激具有抑制作用，減輕其細胞損傷。

關鍵詞：草蓯蓉；多糖；H2O2；氧化應激；HepG2

細胞氧化應激水平的提高能夠損傷細胞甚至導致細胞死亡，因此，自由基與多種疾病的關系已越來越引起人們的重視［1-2］。草蓯蓉（BoschniakiarossicaFedtsch. et Flerov），俗稱不老草，為列當科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，具有補腎壯陽、滋補強身、潤腸止血、延年益壽的功效；用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎以及腎臟和膀胱出血等疾?。?］。草蓯蓉作為傳統中藥，其保肝作用研究已有一定積累［3-5］，但將其有效成分作用于肝細胞的研究鮮見報道。草蓯蓉多糖是其重要活性成分，它無毒，具有免疫增強和抗氧化等功能［5-6］。因此，本試驗選人HepG2細胞為研究對象，利用H2O2誘導HepG2細胞氧化應激，研究草蓯蓉多糖對肝細胞氧化應激的抑制作用，為闡明草蓯蓉多糖保肝機制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

人HepG2細胞：南京凱基生物有限公司；DMEM培養基及胎牛血清（FBS）：Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）：Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）試劑盒：南京建成科技有限公司；小鼠細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）多克隆抗體、兔c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗體、兔p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38）多克隆抗體、兔p-ERK多克隆抗體、兔p-JNK多克隆抗體、兔p-p38多克隆抗體：美國Abcam公司。

1.2儀器

D1320型超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；3-30K型離心機：Sigma公司；RT-2100型酶標儀：深圳雷杜公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀：北京六一儀器廠；Trans-Blot轉印槽：美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀：美國UVP公司。

1.3方法

1.3.1草蓯蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides，BRPS）的制備［5］

采用醇沉法提取BRPS，用Sevag法除蛋白質，最終得率為4.4%，多糖含量為67.3%。

1.3.2細胞培養及傳代［7］

細胞用含10%FBS的DMEM培養液，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下，在細胞培養箱中常規培養。取對數生長期增殖活躍的細胞進行傳代并分組。

1.3.3MTT法檢測細胞存活率［8］

取對數生長期細胞接種于96孔培養板中，繼續培養24 h。加入BRPS溶液使其質量終濃度分別為200、100、50、25、12.5 mg/L。繼續培養24 h，吸凈培養液，加入5 g/L MTT溶液，MTT法測定細胞存活率。以細胞存活率≥90%為標準確定BRPS對細胞的安全濃度［8］。

細胞存活率/%=實驗組/對照組×100

另取一批細胞接種于96孔培養板中，培養24 h后進行分組。對照組、H2O2組（模型組）及BRPS高、低劑量組（質量濃度分別為50、25mg/L）。對照組換入正常培養液；H2O2組加入H2O2使其質量濃度為300 μmol/L；BRPS干預組中加入BRPS使其質量濃度達到相應值，2 h后再加入300 μmol/L H2O2誘導細胞氧化應激損傷。損傷12 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液，MTT法測定細胞存活率。

1.3.4細胞培養液中LDH、ALT、AST活性的檢測［9］

對數生長期細胞按上述方法分組并誘導氧化應激。收集培養液，按照試劑盒說明書檢測培養液中LDH、ALT、AST活性。

1.3.5細胞MDA、GSH含量和SOD活性的測定

細胞在6孔板中進行分組并誘導氧化應激損傷。用胰蛋白酶消化，收集和破碎細胞，離心取上清。按照試劑盒說明書檢測細胞內MDA、GSH、SOD水平［9］。

1.3.6蛋白印跡法檢測細胞ERK、JNK、p38活化水平［9］

收集、破碎細胞，并提取總蛋白。以20 μg為上樣量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移至PVDF膜上。封閉后，一抗孵育過夜，加相應二抗再反應1 h，加發光底物顯跡，采集圖像并進行灰度分析。

1.3.7統計學處理

數據以x±s表示，采用SPSS16.5統計軟件進行數據處理，組間比較采用單因素方差分析。

2　結果與分析

2.1BRPS對HepG2細胞的安全濃度范圍

MTT分析法是檢測細胞活性的常用方法。如圖1所示。

圖1　BRPS對HepG2細胞存活率的影響Fig.1　Effect of BRPS on cell viability of HepG2 cells

質量濃度在12.5 mg/L～50 mg/L范圍時，BRPS不顯示細胞毒作用，細胞存活率≥90%。質量濃度高于100 mg/L時，BRPS具有一定的細胞毒作用。因此，本研究選25 mg/L和50 mg/L為干預計量研究BRPS對H2O2誘導細胞氧化應激的抑制作用。

2.2BRPS對氧化應激細胞存活率的影響

H2O2為一種活性氧，可引發脂質過氧化，增高氧化應激，最終導致細胞損傷甚至死亡［9］。如圖2所示。

圖2　BRPS對氧化應激細胞存活率的影響Fig.2　Effect of BRPS on cell viabilities of cells with oxidative stress

與對照組比較，H2O2組細胞存活率明顯降低（P＜0.05），經BRPS干預后細胞存活率與H2O2組比較增高（P＜0.05）。表明，BRPS干預降低了H2O2所致的細胞損傷，提高細胞活力。

2.3BRPS對培養液中ALT、AST、LDH釋放的影響

肝細胞發生損傷時胞內酶如LDH、ALT、AST等釋放到細胞外，使培養液中胞內酶活性增高，其活性可反映細胞損傷的程度［9］。如表1所示。

表1　BRPS對培養液中ALT、AST、LDH釋放的影響（x±s，n=6）Table 1　Effect of BRPS on releases of ALT，AST and LDH to culture fluid（x±s，n=6）

對照組培養液中LDH、ALT、AST活性較低；與對照組比較，H2O2組培養液LDH、AST、ALT活性顯著升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，BRPS組培養液LDH、ALT、AST活性顯著降低（P＜0.05）。

2.4BRPS對細胞SOD、GSH、MDA水平的影響

細胞MDA可反映脂質過氧化程度，而SOD和GSH是細胞內抗氧化酶和抗氧化劑［9］。如表2所示。

表2　BRPS對細胞MDA、SOD、GSH水平的影響（x±s，n=6）Table 2　Effect of BRPS on levels of MDA，SOD and GSH （x±s，n=6）

與對照組比較，H2O2組細胞MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD活性與GSH含量顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，BRPS組細胞內MDA含量顯著降低（P＜0.05），50 mg/L BRPS組（高劑量組）細胞SOD活性與GSH含量顯著升高（P＜0.05）。25 mg/L BRPS組（低劑量組）SOD活性與GSH含量有增高趨勢，但與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5BRPS對細胞MAPK蛋白激活的影響

MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要有ERK、JNK及p38 MAPK［9］。如圖3所示。

圖3　BRPS對細胞MAPK蛋白激活的影響Fig.3　Effect of BRPS on activation of MAPKs of cells

蛋白印跡結果顯示，H2O2雖不影響ERK和JNK總蛋白的表達，但誘導細胞p-ERK和p-JNK的表達（P＜0.05）。與H2O2組比較，50 mg/L BRPS組p-ERK 和p-JNK的表達水平顯著降低（P＜0.05）。H2O2損傷2 h時，H2O2組p38蛋白激活并不顯著（P＞0.05），50 mg/L BRPS對p38蛋白活化水平也無顯著影響（P＞0.05）。

3　討論

氧化應激損傷是機體遭受各種有害刺激時，氧化與抗氧化體系的平衡狀態被打破所導致的組織、器官等的損傷［10］。氧化應激是各種肝臟疾病發生發展過程中共同的病理生理基礎，因此，抗氧化劑作為肝臟疾病的防治措施是可行的［11］。在H2O2誘導的細胞損傷中，氧化應激是重要環節和機制。當機體受到氧化應激時，胞內生成大量氧自由基，引發細胞膜的脂質過氧化，引起一系列的自由基鏈反應；并大量損耗內源性抗氧化體系，造成GSH含量和SOD活性的降低［1-2，10-11］。此外，受到各種因素的損害時，細胞不能維持其結構的完整性，膜通透性增強，細胞內ALT、AST、LDH等大量釋放到胞外［8，11］。因此，當細胞受到H2O2損傷時，細胞存活率下降、轉氨酶外釋、MDA生成和細胞內抗氧化活力下降等可綜合反映細胞損害的程度［10-11］。本結果表明，BRPS能降低H2O2所致細胞損傷，提高細胞存活率；降低培養液中LDH、ALT和AST活性；降低細胞MDA水平，升高細胞SOD活性和GSH含量；降低ERK和JNK蛋白的活化水平。表明，BRPS對H2O2所致HepG2細胞氧化應激具有抑制作用，可減輕其細胞損傷。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.002

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81160539；81360651）

作者簡介：全吉淑（1968—），女（朝鮮），教授，博士，研究方向：天然產物的活性研究。

*通信作者

收稿日期：2015-04-07

Inhibitory Effect of Polysaccharides from Boschniakia Rossica on Oxidative Stress in HepG2 Cells

QUAN Ji-shu1，WANG Yu-jiao1，YIN Ji-feng2，GAO Feng1，YIN Xue-zhe2，*

（1.Medical College of Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China；2.Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

Abstract：Inhibitory effect of polysaccharides from Boschniakia rossica（BRPS）on cellular oxidative stress induced by hydrogen peroxide（H2O2）in HepG2 cell line was investigated.The cellular oxidative stress model was established in HepG2 cells with H2O2，and then the cell viabilities were detected with MTT assay.Lactate dehydrogenase（LDH），alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），malondialdelyde （MDA），superoxide dismutase（SOD）and reduced glutathione（GSH）were measured by the spectrophotometric method.The activation of extracellular signal-regulated kinase（ERK），c-Jun N-terminal kinase （JNK），p38 mitogen-activated protein kinase（p38）were determined with the western blotting method.Results showed that BRPS had no toxic effect on cultured HepG2 cells at the concentrations of 12.5 mg/L-50 mg/L. However，H2O2decreased the cell viability and antioxidant activities，and increased activation of ERK and JNK.In HepG2 cells with H2O2-induced oxidative stress，the administration of BRPS increased the cell viability，reduced LDH，ALT and AST leakage，reduced the MDA formation，increased the SOD and GSH levels，and suppressed the activation of ERK and JNK.Taken together，BRPS had the inhibitory effect on oxidative stress induced by H2O2in HepG2 cells，and could relieve the oxidative damage of HepG2 cells.

Key words：Boschniakia rossica；polysaccharides；H2O2；oxidative stress；HepG2