飼料氧化魚油對草魚肝胰臟結構和功能的損傷

陳科全葉元土蔡春芳吳 萍黃雨薇吳 韜林秀秀羅其剛張寶彤蕭培珍，

飼料氧化魚油對草魚肝胰臟結構和功能的損傷

陳科全1葉元土1蔡春芳1吳 萍1黃雨薇1吳 韜1林秀秀1羅其剛1張寶彤2蕭培珍1， 2

（1. 蘇州大學基礎醫學與生物科學學院， 江蘇省水產動物營養重點實驗室， 蘇州 215123；2. 北京營養源研究所、水產動物系統營養研究開放實驗室， 北京 100000）

為了探討飼料氧化魚油對草魚（Ctenopharyngodon idellus）肝胰臟組織結構及其功能的影響， 研究以豆油、魚油及氧化魚油作為飼料脂肪源， 分別設計魚油組（6F）、豆油組（6S）、2%氧化魚油（4S2OF）、4%氧化魚油（2S4OF）及6%氧化魚油（6OF）5組等氮、等能的半純化飼料， 在池塘網箱中養殖72d。結果顯示： 氧化魚油顯著增加草魚血清ALB、GLB、MDA和GSH含量（P＜0.05）， 顯著降低肝胰臟GSH和SOD含量（P＜0.05）； 氧化魚油會顯著增加草魚肝胰臟指數及肝胰臟脂肪含量（P＜0.05）， 且草魚血清TG含量顯著上升（P＜0.05）， HDL/LDL顯著下降（P＜0.05）； 氧化魚油使血清及肝胰臟TC含量顯著增加（P＜0.05）， 血清TBA顯著下降（P＜0.05）， 肝胰臟TBA顯著上升（P＜0.05）； 氧化魚油會引起草魚脂肪肝， 損傷肝胰臟細胞線粒體， 并導致肝胰臟細胞纖維化和組織萎縮。結果表明： 飼料添加氧化魚油會引起草魚氧化應激， 并降低草魚肝胰臟抗氧化能力； 擾亂草魚肝胰臟脂肪代謝， 引起脂肪肝； 影響膽汁酸肝腸循環， 使膽汁酸在肝胰臟中堆積， 并損傷肝胰臟細胞線粒體， 最終增加草魚肝胰臟脂肪性肝炎發生率。

脂肪代謝； 膽汁酸； 線粒體； 草魚

魚油因其富含EPA、DHA等長鏈不飽和脂肪酸（LC-PUFA）而對水產動物有很好的營養作用， 但高含量的LC-PUFA會在光照、溫度和氧等因素的影響下迅速被氧化產生過氧化物、酯類、多聚體等氧化產物而對動物體造成損害［1］， 因此魚油對水產動物具有營養作用和氧化損傷的二面性?，F有研究表明， 氧化魚油會導致虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟腫大， 并出現脂肪肝［2］； 鯉（Cyprinus carpio）肝胰臟抗氧化能力下降， 肝細胞受損［3， 4］。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）作為我國主要的淡水養殖經濟魚類， 在實際養殖中也是病害較多養殖魚類之一［5］。肝胰臟是草魚最重要的代謝和解毒器官， 具有代謝脂肪、合成膽汁酸、分泌免疫蛋白、分解有毒物質等眾多功能［6］。近年來， 通過保護動物肝胰臟來加強其自身體抗力的途徑已成為水產動物病害防治的關鍵點， 并越來越受到重視［7， 8］。但關于氧化魚油對水產動物肝胰臟功能和結構的損傷進行系統、深入的研究和探討的報道尚少見。本文以草魚為試驗對象， 以豆油為對照， 研究氧化魚油對草魚肝胰臟細胞、線粒體結構的損傷及對脂肪代謝、膽汁酸循環功能的影響， 期望為闡述油脂氧化產物對魚體肝胰臟結構、功能損傷機制及其作用方式等科學問題提供依據， 為實際生產中飼料油脂的選擇與質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 草魚

草魚來源于浙江一星飼料有限公司養殖基地，為池塘培育的1冬齡魚種， 共350尾， 平均體重為（74.8±1.0） g。草魚隨機分為5組， 每組設3重復， 每重復20尾。分組剩余草魚用于養殖前期取樣分析。

1.2 飼料

以酪蛋白和秘魯蒸氣魚粉為主要蛋白源， 采用等氮、等能方案設計基礎飼料， 設置了6%豆油組（簡稱6S組）、6%魚油組（6F組）、2%氧化魚油+ 4%豆油組（4S2OF組）、4%氧化魚油+2%豆油組（2S4OF組）、6%氧化魚油組（6OF組）共5種半純化飼料， 配方及實測營養指標見表 1。各組蛋白含量為29.52%—30.55%， 無顯著差異； 各組能量為19.943—20.860 kJ/g， 無顯著差異。

表 1 試驗飼料組成及營養水平Tab. 1 POV value， AV value and MDA content in diets

飼料原料粉碎過60目篩， 用絞肉機制成直徑1.5 mm的長條狀， 切成1.5 mm×2 mm的顆粒狀， 風干。飼料置于-20℃冰柜保存備用。

豆油為“福臨門”牌一級大豆油， 魚油來源于廣東省良種引進服務公司生產的“高美牌”精煉魚油，氧化魚油參考文獻［9］方法制備。分別測定3種油脂過氧化值（POV）、酸價（AV）、丙二醛（MDA）， 并計算飼料中POV、AV、MDA值（飼料中AV、POV、MDA測定尚無有效方法， 故采用油脂測定結果的計算值）， 結果分別見表 2。

由表 2可知， 本試驗中使用的魚油有一定程度的氧化， 由于其在飼料中比例為6%， 而氧化魚油組是由氧化魚油和豆油按比例混合作為脂肪源， 所以6F組的實際POV值比4S2OF組高12.25%， 而AV值則比4S2OF和2S4OF組分別高出100%和3.9%。

1.3 飼養管理

養殖試驗在浙江一星飼料有限公司試驗基地進行。在面積為5 m×667 m （平均水深1.8 m）的池塘中設置網箱， 網箱規格為1.0 m×1.5 m×2.0 m。將各組試驗草魚隨機分配在5組、15個網箱中。

分別用試驗飼料馴化1周后， 開始正式投喂， 每天7：00和16：00定時投喂， 投飼率為3%—4%， 每10d依據投飼量估算魚體增重并調整投飼率， 記錄每天投飼量。正式試驗共養殖72d。

每周測定水質一次， 試驗期間溶解氧濃度＞8.0 mg/L， pH 7.8—8.4， 氨氮濃度＜0.2 mg/L， 亞硝酸鹽濃度＜0.01 mg/L， 硫化物濃度＜0.05 mg/L。養殖期間水溫25—33℃。

表 2 試驗飼料中POV值、AV及MDA含量分析結果Tab. 2 POV value， AV value and MDA content in diets

1.4 樣品采集及其分析方法

經72d養殖、禁食24h后進行樣品采集。

肝胰臟組織學樣品制備及分析 每網箱取6尾魚、每組18尾， 單獨記錄其體重和肝胰臟重量，用于肝胰臟指數（HSI）計算， 并收集肝胰臟用索氏抽提法測定其粗脂肪。另每網箱取3尾魚， 于肝胰臟左葉取1 mm3和1 cm3組織塊各1塊， 分別放入4%戊二醛溶液及Bouin試液中固定， 用于透射電鏡和組織學切片分析。

組織學切片采用石蠟切片方法， 蘇木精-伊紅染色， 中性樹膠封片， 光學顯微鏡下觀察肝胰臟組織結構并采用Nikon COOLPIX4500型相機進行拍照。

透射電鏡采用鋨酸固定、丙酮脫水， 最后放入膠囊內包埋切片染色， 用日立HT7700透射式電子顯微鏡觀察肝胰臟組織結構并拍照。

肝胰臟組織勻漿樣品制備與分析 取部

分新鮮肝胰臟， 稱重后加入10倍體積0.02 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）， 勻漿器10000 r/min勻漿1min，3000 r/min冷凍離心10min， 取上清液分裝， 液氮速凍后-80℃冰箱保存。丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）采用南京建成試劑盒測定， 膽固醇（TC）、膽汁酸（TBA）采用雅培C800全自動生化分析儀測定。

血清樣品制備與分析 每個網箱隨機取10尾魚， 以無菌1 mL注射器自尾柄靜脈采血， 置于Eppenddorf離心管中室溫自然凝固0.5h， 3000 r/ min冷凍離心10min， 取上清液分裝后， 液氮速凍并于-80℃冰箱中保存。

MDA、SOD采用南京建成試劑盒。白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、血清膽固醇（TC）、膽汁酸（TBA）采用雅培C800全自動生化分析儀測定。

飼料油脂樣品分析 油脂過氧化值測定參照GB/T 5538-2005； 酸價測定參照GB/T 5530-2005；MDA采用南京建成試劑盒測定。

1.5 數據處理

試驗結果用SPSS 21.0軟件進行統計分析， 采用平均值±標準差（mean±SD）表示， 在單因素方差分析的基礎上， 采用Duncan氏法多重比較檢驗組間差異顯著性， 用Pearson分析方法檢驗數據相關性， 以P＜0.05表示差異顯著， P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 氧化魚油對草魚肝胰臟功能的影響

飼料氧化魚油引起草魚抗氧化損傷應激與氧化損傷 經72d養殖試驗后， 各組草魚血清ALB、GLB、MDA及SOD含量見表 3。

表 3 血清MDA、SOD、ALB、GLB、ALB/GLB測定結果Tab. 3 MDA， SOD， ALB， GLB content and ALB/GLB in serum

由表 3 可知， 相比6S組， 添加魚油或氧化魚油后， 草魚血清ALB、GLB、MDA、SOD含量， 除4S2OF、6OF組ALB含量與6S組差異不顯著外， 其余各組含量均顯著上升（P＜0.05）， 雖然ALB/GLB各組間沒有顯著差異， 但有下降趨勢。在相關性分析中， 血清MDA、SOD含量與飼料油脂中POV值、AV值相關性較大， R2為0.68—0.71， 且相關性極顯著（P＜0.01）。

血清酶學指標能反映魚體整體的生理功能狀態， 上述結果顯示， ALB/GLB有下降趨勢， 表明草魚肝胰臟蛋白質合成能力下降， 且血清中免疫細胞增多， 體內可能有炎癥反應； 氧化物質MDA含量增加， 抗氧化的SOD含量增加， 說明氧化損傷和抗氧化損傷加??； 血清中MDA、SOD含量與飼料油脂中POV、AV值呈極顯著正相關關系， 但與飼料中MDA無顯著相關系， 說明血清中的MDA并不是直接來源于飼料中的MDA， 而可能是來源于飼料中POV、AV引起魚體體內氧化損傷所產生的MDA。上述結果表明， 飼料魚油氧化產物的影響是以氧化損傷為主， 魚體處于氧化損傷與抗氧化損傷的應激狀態； 氧化損傷的程度與飼料中油脂氧化程度呈正相關關系。

飼料氧化魚油引起草魚肝胰臟抗氧化功能下降 經72d養殖試驗后， 各組草魚血清ALT、GGT含量及肝胰臟GSH、MDA、SOD含量見表 4。

表 4 血清ALT、GGT含量與肝胰臟GSH、MDA、SOD測定結果Tab. 4 ALT and GGT content in serum and GSH， MDA and SOD content in hepatopancreas

表 5 氧化魚油對草魚肝胰臟指數、肝胰臟脂肪含量及血清TG、HDL和LDL含量的影響Tab. 5 Effects of oxidized fish oil on the HSI， lipid content of hepatopancreas and TG， HDL and LDL content in serum

由表 4 可知， 在添加魚油或氧化魚油后， 草魚血清ALT、GGT含量及肝胰臟MDA含量各組間差異不顯著， GSH和SOD含量均顯著下降（P＜0.05）。在相關性分析中， 肝胰臟GSH含量與飼料油脂中POV值、MDA含量相關性較大， R2分別為0.69與0.83， 且相關性極顯著（P＜0.01）

上述結果顯示， 血清ALT和GGT含量沒有差異，表明草魚肝胰臟細胞通透性沒有發生顯著性的改變； 雖然血清MDA隨飼料中魚油氧化產物含量增加而增加， 但肝胰臟組織中MDA沒有增加， 還有下降的趨勢， 同時GSH和SOD下降， 說明肝胰臟抗氧化能力下降了。且肝胰臟GSH含量與飼料油脂POV值、MDA含量呈極顯著負相關關系。

飼料氧化魚油有引起草魚發生損傷性脂肪肝的趨勢 經72d養殖試驗后， 各組草魚肝胰臟指數（HSI）、肝胰臟脂肪含量（Lipid）及血清TG、HDL、LDL和HDL/LDL測定結果見表 5。

由表 5 可知， 添加魚油或氧化魚油后， 草魚肝胰臟脂肪含量、HSI顯著上升（P＜0.05）， 血清TG含量也顯著上升（P＜0.05）。血清HDL和LDL含量都有先上升后下降的趨勢， 但HDL/LDL結果顯示， 6S、6F及4S2OF組差異不顯著， 2S4OF及6OF組則顯著下降（P＜0.05）。上述結果顯示， 在飼料中添加氧化魚油后， 肝胰臟指數和肝胰臟脂肪含量、血脂含量均增加， 部分達到脂肪肝標準， 說明草魚肝胰臟有發生脂肪肝的趨勢。

氧化魚油導致草魚肝胰臟膽汁酸淤積 經72d養殖試驗后， 各組草魚血清及肝胰臟中TBA和TC含量見表 6。

表 6 血清、肝胰臟TBA和TC測定結果Tab. 6 TBA and TC content in serum and hepatopancreas

由表 6 可知， 相比6S組， 添加魚油或氧化魚油后， 草魚血清、肝胰臟膽汁酸、膽固醇含量變化如下： ①血清TBA含量顯著下降（P＜0.05）， TC含量顯著上升（P＜0.05）； ②肝胰臟TC含量除6F和2S4OF組、TBA含量除6F組外， 其余各組均顯著上升（P＜0.05）。在相關性分析中， 肝胰臟TBA含量與飼料油脂MDA含量相關性較大， R2為0.65， 且相關性極顯著（P＜0.01）。

上述結果顯示， 血清膽汁酸含量顯著下降、而肝胰臟膽汁酸顯著上升， 說明膽汁酸在肝胰臟中大量淤積； 肝胰臟膽固醇含量上升與HDL/LDL顯著下降結果相一致， 說明肝胰臟將膽固醇等脂類轉運至外周組織的能力下降， 脂肪在肝胰臟聚積可能性增加。且肝胰臟TBA含量與飼料油脂MDA含量呈極顯著負相關關系。

2.2 氧化魚油對草魚肝胰臟結構的影響

草魚肝胰臟組織學觀察 經72d養殖試驗后， 各組草魚肝胰臟組織切片結果見圖版Ⅰ-A-E。

由圖版Ⅰ-A-E可知： 6S、6F組草魚肝胰臟細胞排列整齊， 大小均一； 4S2OF組草魚肝胰臟出現部分因肝胰臟增生而導致相互擠壓變形的細胞（見圖中箭頭所示）； 2S4OF組草魚肝胰臟出現部分細胞細胞核由細胞中央轉移至細胞邊緣（見圖中箭頭所示）；6OF組草魚肝胰臟出現細胞形態異常， 結締組織增生， 且有明顯纖維化趨勢（圖中箭頭所示）。

由表 7可知， 6S、6F、4S2OF和2S4OF組Mn/Mc有減小趨勢， 但無顯著差異， 而6OF組則顯著小于所有組， 說明6OF組中草魚肝胰臟出現實質性損傷。

氧化魚油對草魚肝胰臟細胞線粒體的損傷

經72d養殖試驗后， 各組草魚肝胰臟線粒體透射電鏡結果見圖版Ⅰ-F-J。

由圖版Ⅰ-F-J可知， 6S和6F組草魚肝胰臟線粒體呈正常長桿型， 內部結構清晰， 嵴形態明顯；4S2OF組線粒體形態正常， 但嵴形態模糊； 2S4OF組線粒體形態發生明顯變化， 內部結構模糊， 嵴形態消融； 6OF組線粒體接近圓形， 內部出現大面積空缺， 嵴已基本消融。

上述結果顯示， 氧化魚油會損傷草魚肝胰臟中線粒體， 而導致肝胰臟發生炎癥， 這與本實驗血清ALB和GLB結果相一致。

3 討論

魚油因其富含高不飽和脂肪酸而極易容易被氧化， 所產生的多種中間產物或終產物如醛類、酮類、脂類、多聚體等， 會對水產動物造成氧化損傷與抗氧化應激反應［10， 11］。

3.1 氧化魚油導致草魚氧化應激并造成肝胰臟氧化損傷

MDA作為油脂氧化的終產物［12］， 會交聯蛋白質及磷脂的氨基， 從而降低細胞膜的流動性［13］， 而細胞膜流動性下降后更易被過氧化氫氧化從而產生MDA［14］。SOD和GSH水平作為機體抗氧化狀態的標志［15］， 常作為機體抗氧化能力的指標。本試驗結果顯示， 添加魚油或氧化魚油后草魚血清中MDA和SOD含量均出現顯著上升， 且與飼料油脂中POV、AV值呈正相關關系； 而肝胰臟SOD和GSH含量顯著下降， 肝胰臟GSH含量與飼料油脂中POV值、MDA含量呈極顯著負相關性關系。這說明在本試驗中草魚魚體處于氧化應激狀態， 肝胰臟的抗氧能力顯著下降， 且抗應激程度很大程度上取決于飼料油脂的氧化程度。

表 7 肝胰臟細胞核與細胞個數比值（Mn/Mc）結果Tab. 7 The ratio of hepatopancreas nucleus to hepatopancreas cells

而在本試驗中各組草魚肝胰臟MDA含量沒有顯著差異， 這與Mourente等［16］在用氧化油脂飼喂金頭鯛（Sparus aurata）后得到結果相一致， 他們認為油脂氧化產物在肝胰臟CAT、SOD等抗氧化酶的作用下， 其在肝胰臟中的含量并不會上升。

ALB只能由肝胰臟合成， 而GLB是機體主要的血清免疫球蛋白， 兩者的比值常用來反映肝胰臟的病理損傷程度［17］。在本試驗中6F、4S2OF和2S4OF組血清ALB較6S組顯著上升， 而6OF組與6S組無顯著差異， 說明草魚肝胰臟功能在少量氧化產物的情況下會出現代償性增強， 當氧化產物過高后其功能會受到抑制， 這與HSI結果相一致。而ALB/GLB的顯著下降則表示肝胰臟有因氧化應激而產生炎癥的可能。

血清中ALT和GGT都主要來自肝胰臟， 當肝胰臟受到實質性損傷其細胞通透性增加后血清中ALT和GGT含量會顯著上升［18］。而在本試驗中各組血清ALT和GGT沒有顯著升高， 說明肝胰臟細胞通透性沒有增加。

結果表明， 魚油氧化產物會引起草魚氧化應激，且應激程度與魚油氧化程度正相關； 草魚肝胰臟有發生炎癥的可能， 且炎癥主要發生在肝胰臟細胞內部， 尚未對細胞通透性造成影響。

3.2 氧化魚油干擾草魚膽固醇、膽汁酸代謝

膽汁酸是以膽固醇為原料在肝臟中合成的一種重要物質， 其對膽固醇代謝的調控、及膽汁膽固醇的溶解和對腸道脂類物質的消化、吸收具有重要意義［19］。在正常情況下機體存在“膽汁酸腸肝循環”［20］以循環利用膽汁酸。膽汁酸的腸肝循環是調節膽汁酸合成速率的重要調節機制［21］， 以防止具有毒性的疏水性膽汁酸在肝胰臟內大量聚積而損傷肝胰臟。膽汁酸的腸肝循環過程中任何一個環節發生障礙， 都會導致膽汁酸在肝細胞和肝內膽管內淤積， 從而發生肝胰臟增大、黃疸等疾?。?2］。本試驗結果顯示， 魚油氧化產物會導致肝胰臟膽汁酸、膽固醇含量顯著上升。與6S組比較， 在飼料中添加魚油或氧化魚油后， 草魚血清膽汁酸量顯著下降、膽固醇含量增加， 而肝胰臟是膽汁酸、膽固醇含量均顯著增加， 表明飼料中氧化魚油顯著干擾草魚的膽固醇、膽汁酸代謝， 草魚膽汁酸腸肝循環發生障礙， 膽汁酸大量淤積在肝胰臟中， 且肝胰臟膽汁酸含量與飼料油脂MDA含量極顯著正相關。

在肝胰臟中高含量的膽汁酸會引起疏水性膽汁酸在肝內聚積， 疏水性膽汁酸會溶解細胞膜， 從而引起肝胰臟細胞的壞死， 是膽汁淤積性肝損傷的主要原因［23］。Hino等［24］在小鼠肝臟中發現， 加入抗氧化劑可顯著降低疏水性膽汁酸的毒性， 并且降低肝臟中MDA的含量， 他認為氧自由基與疏水性膽汁酸的細胞毒作用之間存在某種關系。劉菁菁［25］在用富含?；悄懰岬暮懼幚肀贿^氧化物損傷的乳鼠心肌細胞后發現， ?；悄懰峥梢蕴岣呒毎目寡趸芰?， 降低MDA含量。黃延風等［26］在用大黃治療幼鼠肝內膽汁淤積時發現， 熊去氧膽酸也能有效的治療肝內膽汁淤積。富含熊去氧膽酸的熊膽粉可以有效降低因氧化損傷而產生的MDA［27， 28］?？梢娪H水性膽汁酸具有一定的抗氧化能力， 并且親水性膽汁酸可在腸道膽汁酸重吸收時競爭性抑制疏水性膽汁酸的重吸收， 從而減少體內膽汁酸中疏水性膽汁酸的含量［29］。

因此， 本試驗結果顯示， 可能是魚油氧化產物大量消耗體內親水性膽汁酸、導致膽汁酸中疏水性膽汁酸比例上升， 從而堵塞膽管致使草魚肝胰臟中膽汁酸大量淤積， 最終引發肝胰臟炎癥。其具體機理有待進一步分析。

另外， 魚油富含膽固醇， 肝胰臟膽固醇含量的增加是否是由于飼料中魚油添加量增加所致？6F 與6OF組相比較， 在飼料中魚油添加量均為6%， 飼料所含膽固醇量相等。但是， 由表 6結果顯示，6OF組草魚血清、肝胰臟TC含量均高于6F組， 且肝胰臟TC含量顯著高于6F。這個結果表明， 血清、肝胰臟TC含量的增加并不是源于飼料中TC， 而是由于魚油的氧化所致。飼料中氧化魚油引起魚體自身膽固醇生物合成量顯著增加， 這與我們以前的研究結果［30， 31］相一致。膽固醇的去路之一是合成膽汁酸， 對于各組草魚膽汁酸含量的差異， 6F組與6OF組飼料魚油添加量均為6%， 6S組為6%的豆油，6OF組肝胰臟膽汁酸顯著高于6F組、6F組與6S組無顯著差異； 6OF組血清膽汁酸含量顯著高于6F組，表明本試驗中添加氧化魚油后（6OF組）， 草魚肝胰臟膽汁酸含量的增加并非由不同油脂源（6F、6S）所引起的， 而是由于魚油的氧化程度所致。

3.3 氧化魚油增加草魚肝胰臟發生脂肪性肝炎的機率

脂肪肝是指由肝細胞內脂肪堆積過多而導致肝臟病變的一種慢性肝臟?。?2］。Lin等［33］認為， 草魚HSI大于3%， 肝胰臟脂肪含量大于5%即可稱為脂肪肝。但魚類HSI會隨著生長階段和種類的變化而變化［34］， 魚類攝食不同脂肪源其肝胰臟在不發生病變的情況下脂肪含量也會發生較明顯變化［35， 36］。因此， 目前對于魚類脂肪肝還沒有明確的判斷標準。但可以肯定的是， 魚類發生脂肪肝后其肝胰臟脂肪含量會顯著上升， HSI在脂肪肝前期會代償性增加， 后期可能會因肝胰臟實質性損傷而減小， 且肝胰臟中脂肪氧化會加?。?7］， 血脂含量也會增加［38］。

本實驗結果顯示， 添加魚油或氧化魚油后草魚HSI顯著增大， 但6OF組有減小的趨勢（可能是肝胰臟嚴重損傷后出現萎縮性變化）， 肝胰臟脂肪含量顯著增加， 說明肝胰臟脂肪代謝功能受干擾；HDL/LDL顯著下降， 也說明魚油氧化產物會降低草魚將外周組織膽固醇轉運至肝胰臟的能力， 致使血脂含量的上升； 血清TG、TC、HDL和LDL含量均顯著上升， 說明試驗草魚血脂含量顯著上升。上述結果表明， 草魚有發生脂肪肝的趨勢， 再結合杜震宇［39］有關營養型與氧化型脂肪肝的表型比較結果來看， 本試驗草魚脂肪肝接近氧化型脂肪肝。

上述結果表明， 油脂氧化產物會干擾草魚脂肪正常代謝， 但低氧化程度的油脂會引起草魚應激，從而使其肝胰臟代償性增生來代謝一定量的氧化產物。而高氧化程度的油脂， 其氧化產物含量超出草魚耐受范圍后， 會對肝胰臟造成損傷， 使肝胰臟代謝脂肪能力下降， 從而導致脂肪在草魚體內大量沉積， 最終降低草魚生長速度。并且本試驗中［40］氧化魚油導致草魚蛋白沉積率下降、脂肪沉積率上升也和Chen等［41］得到氧化魚油會增加魚類使用蛋白質代替脂肪作為能量消耗的結果相一致。

結合肝胰臟組織切片（圖版Ⅰ-A-E）可以發現：6S、6F組肝胰臟細胞大小均勻、細胞核明顯； 4S2OF組中可發現， 部分肝胰臟細胞出現因增生而相互擠壓導致細胞大小明顯不一； 2S4OF組中則出現部分細胞細胞核向細胞邊緣靠近； 6OF組中肝細胞形態發生改變， 排列不規則， 有明顯纖維化趨勢。這些結果與大口黑鱸（Micropterus salmoides）［42］、紅姑魚（Sciaenops ocellatus）［43］脂肪肝組織學觀察結果相一致， 進一步說明魚油氧化產物會引起草魚脂肪肝。

通過肝胰臟透射電鏡結果（（圖版Ⅰ-F-J）可以發現： 6S、6F組肝胰臟細胞中線粒體為長桿狀的正常形態， 且內部結構完整， 嵴形態明顯； 2OF組中肝胰臟線粒體形態尚正常， 但是內部嵴較分散， 有消融趨勢； 4OF組中肝胰臟線粒體形態發生變化， 內部結構模糊， 嵴結構混亂明顯消融； 6OF組中肝胰臟線粒體形態接近圓形， 內部結構基本全部消融。這與因人工飼喂引起鱸（Lateolabrax japonicas）脂肪肝［44］及用氧化魚油飼喂鯉造成肝胰臟損傷的電鏡結果相一致［3］。

肝胰臟作為各種營養物質代謝和解毒中心， 對氧化魚油的毒性極為敏感。一般認為氧化油脂在腸道消化吸收后， 其結合在乳糜微粒中的氧化產物，一部分會隨血液循環轉運至肝臟［45］， 另一部分會轉運給脂蛋白， 并由脂蛋白運送到各組織， 但其中以轉運至肝臟的最多［46］。而運送至肝臟的次級氧化產物可能先在線粒體中性脂肪上代謝， 然后轉運至微粒體磷脂上代謝［47］。

線粒體是真核細胞重要的細胞器， 生物體內90%以上的氧分子是在線粒體中被消耗的， 而此過程在生物體內具有兩重性： 一方面， 線粒體利用氧分子產生APT， 這是生物體的重要能量代謝過程；另一方面， 線粒體體內的呼吸作用及氧化反應會產生大量有害的氧自由基， 并造成細胞損傷， 導致疾病和衰老［48］。研究發現， 脂肪性肝炎患者普遍存在線粒體腫脹， 氧化呼吸復合體功能下降等［49］， 并認為線粒體反應性氧體系與脂肪肝的發生密切相關。

上述結果表明魚油氧化產物會引發草魚肝胰臟脂肪肝， 并會損傷肝胰臟細胞線粒體而引起脂肪性肝炎。

在本試驗中魚油氧化產物對線粒體的損傷可能由兩方面造成的： （1）線粒體膜富含多不飽和脂肪酸極易被魚油氧化產物中氫過氧化物所氧化， 使線粒體膜流動性下降、通透性增加［50］， 進而肝胰臟中氧化產物大量進入線粒體， 最后導致線粒體變形與溶酶體融合［51］； （2）線粒體反應性氧體系的形成可啟動不飽和脂肪酸氧化從而引發脂質過氧化發生［52］，且魚油氧化產物導致肝胰臟產生應激而消耗大量的GSH及維生素E， 從而降低線粒體抗氧化能力， 最終導致線粒體內部被破壞。

4 結論

飼料中魚油氧化產物會引起肝胰臟氧化應激，其抗氧化能力下降； 使肝胰臟中脂肪轉運發生障礙、脂肪積累增加； 引起草魚肝胰臟中線粒體損傷、肝細胞纖維化； 飼料氧化魚油對肝胰臟的損傷類型為氧化性損傷， 并導致肝胰臟由脂肪肝轉變成脂肪性肝炎、肝纖維化或肝萎縮。氧化魚油會導致草魚體內膽汁酸中親水性膽汁酸含量下降， 從而引起疏水性膽汁酸堵塞膽管， 造成其在肝胰臟中大量淤積， 進而擾亂膽汁酸、膽固醇的正常代謝循環；膽汁酸在肝胰臟淤積會導致肝胰臟脂肪代謝異常，致使草魚肝胰臟成為脂肪肝， 并增加其發生脂肪性肝炎的機率。

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DAMAGE OF OXIDIZED FISH OIL ON THE STRUCTURE AND FUNCTION OF HEPATOPANCREAS OF GRASS CARP （CTENOPHARYNGODON IDELLUS）

CHEN Ke-Quan1， YE Yuan-Tu1， CAI Chun-Fang1， WU Ping1， HUANG Yu-Wei1， WU Tao1， LIN Xiu-Xiu1，LUO Qi-Gang1， ZHANG Bao-Tong2and XIAO Pei-Zhen1， 2
（1. Preclinical Medicine and Biological Science College of Soochow University， Key Laboratory of Aquatic Animal Nutrition in Jiangsu Province， Suzhou 215123， China； 2. Laboratory of Aquatic Animal Nutrition Research System， Beijing Institute of Nutrition，Beijing 100000， China）

To investigate effects of oxidized fish oil on the structure and permeability of hepatopancreas of grass carp （Ctenopharyngodon idellus）， five iso-nitrogen and iso-energy diets were formulated with soybean oil， fish oil and oxidized fish oil at different concentrations， 6% fish oil， 6% soybean oil， 2% oxidized fish oil and 4% soybean oil， 4% oxidized fish oil and 2% soybean oil， 6% oxidized fish oil for a 72d experiment. Result showed that oxidized fish oil significantly increased （P＜0.05） the content of ALB， GLB， MDA， GSH of grass carp serum and significantly reduced（P＜0.05） the content of GSH， SOD of grass carp hepatopancreas. Oxidized fish oil significantly increased （P＜0.05） the HSI， content of lipid of hepatopancreas and TG content of serum， and significantly reduced （P＜0.05） the ratio of HDL and LDL at the same time. Oxidized fish oil significantly enhanced the content of TC on serum and hepatopancreas and the content of TBA on hepatopancreas （P＜0.05） but significantly diminished the content of serum TBA （P＜0.05）. Oxidized fish oil caused fatty liver by disrupting the fat metabolism， mitochondrial damage of hepatopancreas by impacting bile acid accumulation， hepatopancreas cell fibrosis， and tissue atrophyin grass carp. In conclusion， products of oxidized fish oil may cause grass carp oxidative stress and decrease antioxidant capacity of grass carp hepatopancreas.

Fat Metabolism； Bile Acid； Mitochondrial； Ctenopharyngodon idellus

圖版Ⅰ 氧化魚油對草魚肝胰臟形態、結構的影響PlateⅠ Effect of oxidized fish oil on morphology and structure of grass carp hepatopancreas

S963.1

A

1000-3207（2016）04-0793-11

10.7541/2016.103

2015-01-13；

2015-11-05

國家自然科學基金項目（31172417）； 蘇州市應用基礎研究項目（SYN201316）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China （31172417）； Applied Basic Research Programs of Suzhou City （SYN201316）］

陳科全（1990—）， 男， 浙江諸暨人； 碩士研究生； 研究方向為水產動物營養與飼料。E-mail： 326088246@qq.com

葉元土， 教授， 碩士生導師； E-mail： yeyt@suda.edu.cn， Tel./Fax：+86-0512-65880179